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(無題) 削除/引用 No.12598-9 - 2024/09/30 (月) 19:44:54 - 独り言 フェノタイプでKOだと判断できるのであれば、 フェノタイプでKO細胞をクローニングして、目的遺伝子の外来導入でフェノタイプがレスキューするかどうかで、判断するのがよい。 目的遺伝子の活性変異体などあれば、それでレスキューできないことを示せればなおよい。 （内在性発現をそもそも確認したとしても、オフターゲットは否定できないので、レスキューはそもそも必要だと思う）

(無題) 削除/引用 No.12598-8 - 2024/09/30 (月) 19:06:31 - mp frameshiftだと、stopコドンの下流metからの翻訳、変異の入ったexonのskipなどの不安が拭いきれません。AAさんの言うように、2つのガイドを用いたlarge deletionなどが選択肢に入ってくるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.12598-7 - 2024/09/30 (月) 15:33:34 - AA ORF全長を欠損させて、そのうえでmRNAで評価してはどうでしょうか？ 全長だとintron中に他の遺伝子や制御領域がないか不安、というのであれば機能的に重要そうな領域をコードしているexonに絞ってもいいかと思います。 フレームシフトだとqPCRなどでは評価できないですがある程度の長さの領域を欠損していれば増幅の有無で評価できると思います。

(無題) 削除/引用 No.12598-6 - 2024/09/30 (月) 14:43:52 - toto >[Re:5] あああさんは書きました : > nullで遺伝子を削ってあるならタンパク質を確認する必要はないです。 たしかにすべてが想定通りであれば要らないのですが、すべてのalleleで落ちているのか（特に培養細胞では）、遺伝子があまりよく研究されていないものである場合には、そもそもそのタンパクはそのエクソンから本当に作られているのか、等といった基本的なことの確認のために、論文に投稿したときには抗体での確認が要求されることも割とあります。ただ、適した抗体がない場合は、今後も利用価値のあるものなら作りますが、そのためだけであれば、作るほどでもない、という感じでしょうか。そういう抗体がないので行わなかった、でも、やさしいreviewerなら通してくれるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12598-5 - 2024/09/30 (月) 11:19:26 - あああ 良くあることですが、具体的に何を危惧しているかを書かないと対応の仕方が決まらないでしょう。 ノックアウトコンストラクトに何かしらのぬけがある可能背があるなら、それを確認すればいいのではないですか。 nullで遺伝子を削ってあるならタンパク質を確認する必要はないです。

(無題) 削除/引用 No.12598-4 - 2024/09/29 (日) 17:01:56 - おお 信頼できない理由はなんでしょうか？IP するとか、局在に注目してフラクショネーションで共雑物を減らしてターゲットの濃度を上げるとか。 ShRNA にしても発現をチェックする時点で抗体の問題にぶつかると思う。 また、crispr でゲノムをいじった時には、ゲノムの配列を確認するものかと。 設計の時点で最初のMetが飛びそうな設計にするとかであれば、100％出ないにしろ、KOが成立しているということで進めれなくもないかもしれない。 あるいは、GFP などのノックインにしてしまうとか。

(無題) 削除/引用 No.12598-3 - 2024/09/29 (日) 14:35:53 - 初学者 どうも有難う御座います。 フレームシフト＝ノックアウト　と考えても良いのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12598-2 - 2024/09/29 (日) 13:17:50 - s そのような場合は、目的のエクソンを含むゲノム配列のシーケンスでフレームシフトを確認するのはいかがでしょうか。 あとは、抗体作製依頼するのもありかもしれません。

良い抗体のないタンパクのノックアウト 削除/引用 No.12598-1 - 2024/09/29 (日) 12:41:39 - 初学者 　CRISPR/Cas9である遺伝子をノックアウトしたいと考えているのですが、その遺伝子のコードするタンパクには信頼できる抗体がなく、ノックアウトできているかタンパクレベルで確認できません。このような場合、どうすればよいでしょうか？CRISPR/Cas9はあきらめてshRNAを用いるなど、何かアドバイスがあれば宜しくお願いします。

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