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ノックイン細胞株作成について トピック削除
No.12597-TOPIC - 2024/09/28 (土) 21:05:31 - ノックイン
ヒト培養細胞のゲノムDNAに約30塩基を挿入したノックイン細胞株を作製したいと考えています。
CRISPR/Cas9を使用する予定で、まず標的ゲノム配列を切断できるsgRNAは設計できました。
挿入配列を含む1本鎖DNAオリゴをsgRNA/Cas9と一緒に導入したところ、目的の配列が挿入された細胞は得られませんでした。
ゲノムが切断されて様々なindelが入っている細胞は得られています。
ssODNの配列は挿入配列の前後に約30塩基の相同配列を含むトータル約100塩基としています。
相同組換えを促進するというHDR Enhancerという化合物（成分不明）も使用してみましたが、それでもノックインされた細胞は得られませんでした。

目的のノックイン細胞を得るために改善できる点がありましたらアドバイス頂けないでしょうか。
よろしくお願い致します。
　
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(無題) 削除/引用
No.12597-7 - 2024/10/03 (木) 02:05:27 - おお
アイデアだけを落としていっていて助けになるかわからないけど、反対の鎖の配列からssODNを作るとどうだろうか、、、

(無題) 削除/引用
No.12597-6 - 2024/10/01 (火) 00:28:49 - おお
ならばssODNの長さやTFの量をいじるとかでしょうか。細胞内のssODN濃度を上げると反応が起こる確率が上がると思うので。やり方としては変則的ですがまずssODNを導入しておいて、その後Cas9 gRNA ssODNを導入するとか。
近傍２箇所で切ってやれば効率上がるとかありますかねぇ。

机上の空論でありますが。。。調査できればもう少し具体的なことがかけるのですが、、、

(無題) 削除/引用
No.12597-5 - 2024/09/30 (月) 21:46:39 - ノックイン
ご意見いただきましてありがとうございます。

情報後出しになってしまいますが、ssODNは末端ホスホロチオエート修飾済のものを使用していました。

Electroporation enhancerは試したことがないので、一度試してみたいと思います。

私がノックインしたい細胞はけっこうメジャーな白血病細胞株で、これまでにその細胞で複数の遺伝子の一塩基置換株を作製しており、一塩基置換はさほど苦労せず変異クローンが得られました。
iPS細胞も使える環境なので、試しにiPS細胞でもノックインできるか試そうと思います。

(無題) 削除/引用
No.12597-4 - 2024/09/30 (月) 10:39:09 - asan
ssODNによる培養細胞株へのKIは世の中で単純に見えるけど、いうほど簡単ではありません。

結構トリッキーなケースもあるので、細胞によっては相当頑張らないと難しいものもあります。


逆に、ESやiPS細胞などのHDR活性が高いものや受精卵の方が効率がいいケースも多々あります。

まずは自分の実験でポジコンを動かすとか、前例が少ない細胞腫でやってる場合は簡単なものでうまくいく条件でやることを進めます。

30base程度ならprime editor とかそれ以外の方法を考えるのもありだと思います。

(無題) 削除/引用
No.12597-3 - 2024/09/30 (月) 10:34:29 - pst
IDTのsgRNAを使用して色々実験していますが、個人的にはHDR enhancerよりもElectroporation enhancerの方がHDR効率を上げているように感じます。

(無題) 削除/引用
No.12597-2 - 2024/09/29 (日) 18:03:21 - おお
https://www.idtdna.com/pages/products/crispr-genome-editing/alt-r-hdr-donor-oligos

ドナーオリゴの安定性を上げるために、モディフィケーションを施したものもるようですが、

ノックイン細胞株作成について 削除/引用
No.12597-1 - 2024/09/28 (土) 21:05:31 - ノックイン
ヒト培養細胞のゲノムDNAに約30塩基を挿入したノックイン細胞株を作製したいと考えています。
CRISPR/Cas9を使用する予定で、まず標的ゲノム配列を切断できるsgRNAは設計できました。
挿入配列を含む1本鎖DNAオリゴをsgRNA/Cas9と一緒に導入したところ、目的の配列が挿入された細胞は得られませんでした。
ゲノムが切断されて様々なindelが入っている細胞は得られています。
ssODNの配列は挿入配列の前後に約30塩基の相同配列を含むトータル約100塩基としています。
相同組換えを促進するというHDR Enhancerという化合物（成分不明）も使用してみましたが、それでもノックインされた細胞は得られませんでした。

目的のノックイン細胞を得るために改善できる点がありましたらアドバイス頂けないでしょうか。
よろしくお願い致します。
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