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(無題) 削除/引用 No.12595-10 - 2024/10/14 (月) 19:55:50 - なす こちらの件、解決しました。 siDirectで出力されるpassenger鎖の配列は21ntですが、RISKに取り込まれるガイド鎖は末端2ntが削られpolyUが付加されるようです。 つまりパッセンジャーは2ntの相補的配列を、ガイド鎖はUUをoverhangとして持っています。 mRNAの認識に使われる配列は結局19ntなので、末端を2nt削る方法に大きな問題はないようです。 パッセンジャー: NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN ガイド : UUNNNNNNNNNNNNNNNNNNN ではどうして21ntで出力される必要があるのか？というのが次の疑問にはなります…。 調べた限りでは、二本鎖si配列において、2ntのoverhangがターゲットと相補的な鎖がRISKに取り込まれやすいようです。 パッセンジャーを19+2ntの相補的配列で作るとむしろパッセンジャーが取り込まれ、ガイド鎖が取り込まれにくくなるように思えます…。 パッセンジャーのoverhangもUUになるようにしてしまうべきではないでしょうか…？

(無題) 削除/引用 No.12595-9 - 2024/09/29 (日) 10:49:14 - おお >[Re:6] なすさんは書きました : > > 19でも21でもアルゴリズム上での結果はほとんど変わらないという趣旨の解析はあるので問題ないと思います。 > > 自分も昔siDirectで作製した時はそんな感じで2つのぞいてつくってました。 > > 安心しました。とても参考になります。 実際に両方のアルゴリズムで抽出して、重なっているやつがどの部分が19でないのか一定の法則がない場合、削り方によって変わる可能性が気になりますね。

(無題) 削除/引用 No.12595-8 - 2024/09/29 (日) 10:41:18 - おお https://biosettia.com/shrna/plv-rnai-protocols/design-shrna/ このベクターは特に長さが19とか21とか指定がなくどちらか選べばいいような書き方。 https://cellandbioscience.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13578-015-0058-2 同じベクターないで長さなどの比較で19から21で良好な抑制効果が見られている。 19や21に特化したベクターがあれば別だが、そういうのあるのだろうか？

(無題) 削除/引用 No.12595-7 - 2024/09/28 (土) 09:18:49 - mimi 19でも21でも変わらないというのは、それぞれのアルゴリズムが導き出したデザインに関してのことで、21で導き出したデザインの末端を削って19にしても大丈夫ということではないのでは？

(無題) 削除/引用 No.12595-6 - 2024/09/27 (金) 19:13:51 - なす > 19でも21でもアルゴリズム上での結果はほとんど変わらないという趣旨の解析はあるので問題ないと思います。 > 自分も昔siDirectで作製した時はそんな感じで2つのぞいてつくってました。 安心しました。とても参考になります。

(無題) 削除/引用 No.12595-5 - 2024/09/27 (金) 19:12:39 - なす ご回答ありがとうございます。 おお様 > このベクターにtarget 21nt+0verhang 2nt(+ヘアピン配列 12nt)を入れたら変になるという理屈があるのでしょうか。 恐縮ながらそこがわからないのです…。 結局ヘアピン形成やノックダウン効率はベクターの設計によるものではなく、そのオリゴ配列のみで決まると認識しているので、上記の配列を入れても問題ない気がするのですが。 問題なければその配列を入れたいところです。

(無題) 削除/引用 No.12595-4 - 2024/09/27 (金) 18:07:21 - asan 19でも21でもアルゴリズム上での結果はほとんど変わらないという趣旨の解析はあるので問題ないと思います。 ttps://academic.oup.com/nar/article/35/18/e123/2402822?login=true サイズの違いはshの安定性とか、インターフェロン応答の副反応とか設計の特異性などにも依存するのでどちらが一概にいいかはいえません。好みの問題だと思いますが、アルゴリズムによって示されたものを踏まえて、そのベクター作成者が19 merでプロトコールを出してるからそれに従って経験上端を削って作ってるってだけだと思います。最近はmiRNAベースのものが効率がいいので自分はほぼそれをつかいうか、sigmaのバリデートされたものを買ってしまうので新たに作製することは自分はほぼないですが、自分も昔siDirectで作製した時はそんな感じで2つのぞいてつくってました。 ttps://bmcmolbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2199-5-9 あとは、21merじゃなくておもっと長い27merとかそういうのも世の中的には売ってます。 ttps://sg.idtdna.com/jp/site/DsiRNA.html

(無題) 削除/引用 No.12595-3 - 2024/09/27 (金) 02:06:12 - おお >[Re:1] なすさんは書きました : > せっかくアルゴリズムで計算された配列を勝手にこちらでいじってしまうと、特異性とノックダウン効果に問題が生じないでしょうか？ > それともターゲットの位置さえあってれば2個削る程度は問題ないのでしょうか？ 一応配列のがターゲットに結合したときの安定性（Tmとか）、効果ある塩基配列の特徴（たぶんDeep learningでアルゴリズムを決めている）で配列を割り出してますから、それに合わなくなる可能性はあるかと思う。ただ、効果のあるであろう場所はオーバーラップして何個か候補が出ることもあるので、削っても効果がある場合があるのも理解できる。 １９ベースで探してくれるデザインToolもあったような気がします。探してみてはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12595-2 - 2024/09/27 (金) 00:46:43 - おお >研究室にあるプラスミドのマニュアルではtarget 19nt+ Overhang 2nt (+ヘアピン配列 9nt)を想定されています。 このベクターにtarget 21nt+0verhang 2nt(+ヘアピン配列 12nt)を入れたら変になるという理屈があるのでしょうか。

shRNA発現ベクターのターゲット配列の長さについて 削除/引用 No.12595-1 - 2024/09/26 (木) 19:48:43 - なす いつもお世話になっております。 私はshRNA発現ベクター作製のためのターゲット配列の選択に、siDirectというサイトを利用しています。 このサイトではtarget 21nt+0verhang 2nt(+ヘアピン配列 12nt)配列が提示されます。 しかし、研究室にあるプラスミドのマニュアルではtarget 19nt+ Overhang 2nt (+ヘアピン配列 9nt)を想定されています。 これまではsiDirectででてきた21ntの末尾を削って無理やり19ntにしてあてはめているのですが、大きな問題があるような気がしてなりません。 (ただ、このやり方で実際ノックダウンに成功はしています…。) せっかくアルゴリズムで計算された配列を勝手にこちらでいじってしまうと、特異性とノックダウン効果に問題が生じないでしょうか？ それともターゲットの位置さえあってれば2個削る程度は問題ないのでしょうか？

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