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(無題) 削除/引用 No.1259-14 - 2012/12/24 (月) 14:16:56 - mi1 おおさん すみません。そのキットは使ったことがないので分かりません。 私は手広く色んな生物からRNAを抽出してますが、植物に関してはそこまで経験が深いわけではないので、一般論で書いています。 植物に特化すると別の話になるかもしれませんが、一般論として、 ある試料の多糖類がうまく除ける方法でも他の試料では全く除けない ということはかなり頻繁にあります。 「多糖類」と称しているものをユニバーサルに除く手段は存在しない、というのが私の経験上の結論です...

(無題) 削除/引用 No.1259-13 - 2012/12/22 (土) 17:13:32 - おお >[Re:12] mi1さんは書きました : > 多糖類の性質と量によっては、泳動もされますし、核酸の染色試薬で染まりもします。分解したRNAのようにレーンの上から下の方までべたっと染まったこともあります。 > > 本当にRNAの分解なのか、多糖類のせいなのかを確認した方が良いでしょうね。私はどちらの可能性もあると思います。 Qiagenの植物用のRNA抽出キットも使っているようですが、それでもそういうの起こりますかね?

(無題) 削除/引用 No.1259-12 - 2012/12/22 (土) 14:40:08 - mi1 多糖類の性質と量によっては、泳動もされますし、核酸の染色試薬で染まりもします。分解したRNAのようにレーンの上から下の方までべたっと染まったこともあります。 本当にRNAの分解なのか、多糖類のせいなのかを確認した方が良いでしょうね。私はどちらの可能性もあると思います。 RNaseの活性が強い（または破砕や溶解が難しい）組織の場合、他の組織で問題なく取れるプロトコルで失敗なくうまくやったのに分解してしまったということはよくあります。 植物の場合、色んなメソッドが報告されていますからお調べになると良いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1259-11 - 2012/12/20 (木) 03:52:36 - おお >[Re:10] こうじさんは書きました : > 一つ気になるのが > 多糖やポリフェノール系の影響は考えたプロトコールでしょうか？ > Isogenならオプションのプロトコールに記載されています > これらは電気泳動が乱れ、純度が落ちる原因でもあるはずです > > 回収されたRNAのUVスペクトルからある程度判断できるはずです。 > そうですね。キットによっては多糖など抜く操作が必要になるかもしれません。ちなみにそういうものの混入でどのようにエイどうがみだれますでしょうか。 糖類はUVでそんなに影響がありますか? ん230当たりに何か吸収があるのかな?

(無題) 削除/引用 No.1259-10 - 2012/12/19 (水) 16:51:50 - こうじ 一つ気になるのが 多糖やポリフェノール系の影響は考えたプロトコールでしょうか？ Isogenならオプションのプロトコールに記載されています これらは電気泳動が乱れ、純度が落ちる原因でもあるはずです 回収されたRNAのUVスペクトルからある程度判断できるはずです。

(無題) 削除/引用 No.1259-9 - 2012/12/18 (火) 18:59:46 - ミズノ おおさん 返信ありがとうございます。 > 見たい組織でアポトーシスが始まっているという事はないでしょうか? 見かけ上、枯れている葉を除いて、サンプル回収を行っているので、その可能性は考えていませんでした。 ご指摘頂いたように、抽出液の量を変えて、RNA抽出を再チャレンジして見ようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1259-8 - 2012/12/18 (火) 18:54:17 - ミズノ >[Re:5] えーすさんは書きました : > 植物は門外漢で頓珍漢な意見かもしれませんが、 > > RNaseの量が問題であれば、サンプルと抽出試薬の比率を変えればうまくいきそうですが。 > RNaseの質的な問題で不活化できてないとすれば、AGPC法以外の抽出方法にしないといけないのかなと。 > えーすさん コメントありがとうございます。 キットであることからプロトコル通りしかやったことがなかったので、比率を変えてやってみようと思います。 かつ、他の抽出法も検討しようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1259-7 - 2012/12/18 (火) 18:44:19 - ミズノ himawariさん コメントありがとうございます。 >[Re:3] himawariさんは書きました : > 凍結させたサンプルから抽出までの流れが書いてないのでわかりませんが、経験上、この辺がポイントだと思います。 私は、液体窒素で凍結させたサンプルを乳棒ですりつぶしていますが、ですが液体窒素が無くなった後も、凍結したISOGENなどの試薬をサンプル混ぜる際に乳棒を使用してすりつぶしながら混ぜています。もちろん試薬が凍結している間のみです。 おそらく、ここの過程がhimawariさんと大きく異なっていると思われます。 試薬が凍結した場合、液体になるのを待ってからピペッティングしてされてますか？ お手数ですが、ご返答下されば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1259-6 - 2012/12/18 (火) 17:33:18 - おお >[Re:4] ミズノさんは書きました : > 私もおおさんと同じ点で、RNaseが不活性化できていないことへ疑問を抱きました。ですが、植物は開花時など状態によってRNaseが高発現していることもあるようなので充分にRNaseを不活性化できていないでは、という考えに至りました。 いや高発現だから試薬で不活性化しないということではないとおもいます。しいていうなら、いかにライセイトにするときに速やかに変性能力のあるRNA抽出溶液に抽出し分散させるかということだと思います。気になるなら試薬を多めにつかうとRNaseの濃度はおちますが、、、 動物細胞であれば、ポリトロンというミキサーの小さいのみたいなもので一気にかき回しながら即座にRNA抽出溶液に分散させるということもします。 見たい組織でアポトーシスが始まっているという事はないでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1259-5 - 2012/12/18 (火) 17:15:01 - えーす 植物は門外漢で頓珍漢な意見かもしれませんが、 RNaseの量が問題であれば、サンプルと抽出試薬の比率を変えればうまくいきそうですが。 RNaseの質的な問題で不活化できてないとすれば、AGPC法以外の抽出方法にしないといけないのかなと。

(無題) 削除/引用 No.1259-4 - 2012/12/18 (火) 16:52:10 - ミズノ >[Re:2] おおさんは書きました : > タンパク質変性剤が入っているため、試薬を使うと同時にRNaseが不活化されるので、本当にそこが問題かもう一度疑った方がいいのでは。 > > もちろん材料によっては、試薬にRNAが溶け出てくるのに時間がかかったりしてその間に壊れる物もあるかも思いますが、、、それであれば、ホットフェノール法とかあったような気がしますが、詳細はご自分でおさがしください。 おおさん コメント、ありがとうございます。 私もおおさんと同じ点で、RNaseが不活性化できていないことへ疑問を抱きました。ですが、植物は開花時など状態によってRNaseが高発現していることもあるようなので充分にRNaseを不活性化できていないでは、という考えに至りました。 ホットフェノール法は、まだやったことが無いので確認してみます。 教えて頂きありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1259-3 - 2012/12/18 (火) 12:42:56 - himawari 凍結させたサンプルから抽出までの流れが書いてないのでわかりませんが、経験上、この辺がポイントだと思います。 原始的ですが、私は液体窒素を乳鉢に入れながら凍結させたサンプルを粉砕し、液体窒素がなくなる寸前にIsogenやTrizolをぶち込んでよくピペッティングします。 この過程が迅速に対応できていないと分解する確率が高くなるかな。 RNeasyは抽出効率が悪かったので今は使っていません。 植物はミズヒキ、ホウノキ、カンゾウ、ムラサキなどからRNA抽出経験あり。

(無題) 削除/引用 No.1259-2 - 2012/12/18 (火) 00:09:11 - おお タンパク質変性剤が入っているため、試薬を使うと同時にRNaseが不活化されるので、本当にそこが問題かもう一度疑った方がいいのでは。 もちろん材料によっては、試薬にRNAが溶け出てくるのに時間がかかったりしてその間に壊れる物もあるかも思いますが、、、それであれば、ホットフェノール法とかあったような気がしますが、詳細はご自分でおさがしください。

植物体からのRNA抽出過程における、内在性RNase の不活性化 削除/引用 No.1259-1 - 2012/12/17 (月) 17:59:10 - ミズノ 植物体からRNA抽出を行っている方へ質問です。 現在、私は多年生の水生植物からRNA抽出を行っています。 主にキットを使用していますが、抽出したRNAを電気泳動すると、バンドがスメアになってしまいます。 試したキット ■ISOGEN (ニッポンジーン) ■Plant RNA Isolation Reagent (invitrogen)←特徴：Trizolの２倍効果的 ■RNeasy (キアゲン) そこで、RNA分解の対策として２つのトラブルシュートを試みました。 ----------------------------------------------------------------------- �@ RNaseのコンタミ 試薬や器具からのRNaseのコンタミを疑い、本研究のサンプルと異なる植物を用いてRNA抽出を行いました。 (結果)本研究のサンプルと異なる植物では、分解させずにRNA抽出できる ----------------------------------------------------------------------- �A サンプル保存状態 次にサンプルの保存状態を疑いました。以前は１年前に液体窒素で凍結し−８０℃で保存したサンプルを使用していました。そこで、新鮮な状態から速やかに液体窒素で凍結を行い、RNA抽出を行いました。 (結果)サンプルの保存状態で結果は変わらない ----------------------------------------------------------------------- 私は、これらの結果から、内在性RNaseが不活性化できていないと疑っていますですが、キットに内在性RNaseへの対策として、タンパク質変性剤が入っているため、トラブルシュートの具体的な対策が見つからず困っています。 内在性RNaseへの対策をご存知の方いらっしゃいましたら、ご意見よろしくお願いします。

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