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(無題) 削除/引用 No.12586-7 - 2024/09/27 (金) 10:22:44 - 独り言 昔はligationでやってましたが、数年前からはligationはラボで一切やめて、すべてNEBのgibson assemblyでやってます。 理由は、 インサートが入る効率が断然いい。（学生がligation失敗して、やり直しのコストや時間の節約になる） ５ｋbpぐらいの断片でも問題ない。（それ以上長いのは経験がない） 大体インサート１個で行うが、２，３個必要な時もいっぺんに入れることもできる。 当ラボでは、レンチウイルスやレトロウイルスベクターなど反復配列あるベクターも問題なくできている。 推奨のプロトコールは２ｘmaster mixを用いて合計20ulの反応ですが、2xmixのバッファーを1ulと精製したPCR産物合計1ul、反応液合計2ulで行えているので、１５０円/１回ぐらいで済む。

(無題) 削除/引用 No.12586-6 - 2024/09/26 (木) 19:30:07 - なす 皆さま有難うございます。 774R様 私のイメージしていたやり方は変異部分周辺でインサートを二つに分割しダブルfusionするものでしたが、インバースでも可能なのですね。 おお様 実状に即したご助言ありがとうございます。 ステップが少ないが故の成功率の高さという側面もあるのですね。 あ様 もしよろしければその他の欠点なども教えていただけるとありがたいです。 個人的には、In fusionとLigationでどうして長い断片の挿入効率が違うのか不思議です。 In fusionも原理的には結局Ligationなので、長い断片になるほど効率は大きく下がりそうですが…。

(無題) 削除/引用 No.12586-5 - 2024/09/25 (水) 17:48:55 - 774R 値段を見に行ったら10回分で20000円。 1/5にスケールダウンしても余裕で使えるので、50回分と思えば400円/回 買うならInFusion HDではなく、後継品のIn-Fusion® Snap Assembly Master Mixの方が断然良いです。

(無題) 削除/引用 No.12586-4 - 2024/09/25 (水) 16:34:26 - あ 私には ・複数断片の同時挿入が可能 が最大のメリットなのですが、欠点も多いですよ。ウイルスベクターに使えないとか、割高とか。

(無題) 削除/引用 No.12586-3 - 2024/09/24 (火) 02:42:15 - おお >2) 変異導入 >…私はインバースPCR PCRベースで似た手法はいくらかありますがそれはさておき、 プラスミドをPCRするときの危険性として、発現させる配列以外にも変異ができる可能性です。Ampに変異が入って機能が失われていれば増えてこないので（変異が入っても増えてくれば機能しているし問題ないとも言えるし）そういうのはあまり関係がないですが、プロモーターとか変異が入ると発現量に影響を与える可能性があります。 ならば適当な周辺の制限酵素が使えるところで変異をいれたPCR断片をいれるという発想になるかもしれませんが、PCRフラグメントは通常のLigationを使う方法ではプラスミドから切り取ったフラグメントより若干効率が悪いというか、劣るというかそういう側面があります。また、末端に制限酵素認識部位を入れて切るとかステップも多いし、それぞれのステップでなにか問題がある場合もある。それに対してIn fusionなどステップが少なく意外とうまくいくなという印象は経験が少ないながらもあります。 まあIn fusionでもベクター側をPCRで増やすこともあるので、そういった場合変異云々において利点はないですけど。

(無題) 削除/引用 No.12586-2 - 2024/09/24 (火) 00:34:00 - 774R 1) 長い断片の挿入 成功率高いです。 2) 変異導入 変異を入れたプライマーペア（15bpのオーバーラップあり）でインバースPCR後、セルフライゲーションみたいにセルフInFusionするとほぼ確実に成功する。

In-fusionの有用性を教えてください 削除/引用 No.12586-1 - 2024/09/23 (月) 21:45:17 - なす 最近In-fusionを用いたプラスミド作製を知り興味をもっている者です。 私なりに調べたところ、In-fusionのメリットは ・複数断片の同時挿入が可能 ・制限酵素部位に依らずに自由に挿入が出来る あたりと認識しています。 以下の点についてIn-fusionがLigationよりも有用なのかどうか、調べてもよく分かりませんでしたので、使用経験のある先生方、ご教示頂けませんでしょうか。 1) 長い断片の挿入 …T4リガーゼによるLigationだと3kbpを超えると難しくなってくる印象ですが、In-fusion kitのカタログでは15kbpまで挿入可能と書いてありました。実際のところ長い断片の挿入の成功率はLigationと比較してどうでしょうか？(私は6-9kbpの断片の挿入を計画しています) 2) 変異導入 …私はインバースPCRとセルフライゲーションを組み合わせた方法くらいしか知らないのですが、In-fusionを使った方法の方が一見時間も成功率も良さそうに思えます。実際のところどうでしょうか？

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