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(無題) 削除/引用 No.12576-14 - 2024/10/03 (木) 02:10:33 - ま 乾熱滅菌器を利用し95℃で煮沸しないように賦活化していたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.12576-13 - 2024/09/20 (金) 22:14:43 - ふらいむ 市販の調製済の抗原賦活化液を使用してみてはどうでしょう。 例えばナカライのHistoVT Oneなら70℃20分が凍結切片の標準なので、 切片の剥がれも抑えられると思います。

(無題) 削除/引用 No.12576-12 - 2024/09/19 (木) 18:10:53 - あああ 1様 ありがとうございます。 煮沸時間を短く、温度を少し下げてみたところ、若干の改善がありました。

昔の質問と回答でこんなのあった 削除/引用 No.12576-11 - 2024/09/18 (水) 15:31:52 - 1 昔の質問と回答でこんなのあった。たぶん有用な情報と思う。 ttp://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1169

(無題) 削除/引用 No.12576-10 - 2024/09/18 (水) 12:41:41 - あああ 皆様 最近行った別の実験で、凍結切片を賦活化したことで今まで染まらなかったサンプルが染まった経験をしたため、今回も凍結切片の賦活化を行っています。(事前に賦活化なしで染色できるか確認済み。染まりませんでした。) 1様 抗体はIFでも使用できると説明書に記載してありました。 賦活化条件についてですが、5-10minで充分ということは初めて知りました。ありがとうございます。 沸騰する時の気泡によって切片が捲れ上がってしまい剥がれてしまうのかと考え、気泡が出ない温度(80度くらい？)で賦活化を行ってみようかと考えているのですが、サンプルを煮る際に沸騰させないと行けないのでしょうか？もしご存知でしたら教えてください。 あの様 組織の収縮力によって剥がれてしまうことがあるんですね。 知りませんでした。ありがとうございます。 また酵素を用いた賦活化も煮沸法がうまく行かなければ検討してみようと思います。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12576-9 - 2024/09/18 (水) 09:11:31 - あの 補足しますが、強い酵素を使って条件設定で苦労した経験があります。そのため最近は、当方でもし酵素を使う必要があるなら、アキュターゼが第一候補です。 また凍結切片に対して煮沸するという論文を見たことはありますが、煮沸はパラフィン切片のものという感覚です。 当方のサンプルでは、たとえ数分の煮沸でも切片が縮んで剥離したので、それ以後は使ったことはありません。煮沸できるかどうかは、あくまでサンプル次第と考えています。 舌は難しそうだなと予想はしています。サンプルに余裕があるなら、試してみたらよいと思いますが、ダメっぽかったら、煮沸にこだわって試行錯誤する必要は無いと思います。

(無題) 削除/引用 No.12576-8 - 2024/09/17 (火) 23:55:15 - 1 酵素法による賦活処理にはproteinase Kがよく使われます。抗体とエピトープの接触を邪魔している抗原の近くの蛋白質を適度に分解してアクセスしやすくします。基質特異性の高いcollagenaseやelastaseと異なり非特異的にいろんなタンパク質に働く面で利点があります。ただ大変強力なproteaseなので、やりすぎるとエピトープの構造自体を破壊してしまうことあるので、やや扱いが面倒で、あらかじめ予備実験でいい感じの反応時間などをよく検討する必要があります。経験では成功率は加熱の方がはるかに高いです。

(無題) 削除/引用 No.12576-7 - 2024/09/17 (火) 21:42:43 - あの それから、コラーゲン等の細胞外マトリックスが多い場合には、アキュターゼ等のマイルドな酵素で処理すると、ターゲットに抗体が近づきやすくなるので改善することがあります。 酵素はコラゲナーゼだと強烈すぎて、組織構造が破壊されます。 また、蛍光シグナルが弱い場合でも、蛍光顕微鏡ではなく、共焦点顕微鏡を使うと問題解決することがあります。

(無題) 削除/引用 No.12576-6 - 2024/09/17 (火) 21:38:08 - あの マウスの舌を研究した経験はありませんが、もしコラーゲン等の多いサンプルなら、 煮沸時間のほかに、切片厚も注意が必要です。 縮む力が強いと、剥がれてしまうという、イメージです。

(無題) 削除/引用 No.12576-5 - 2024/09/17 (火) 20:52:12 - 1 通常、凍結切片の場合は、一晩〜数日とかの長時間のPFA固定やパラフィン包埋での一連の過酷な処理など抗原をマスキングするような工程がないので、通常は抗原賦活は必要ない場合がほとんどなのですが（もちろんごく少数ながら例外は経験ありますが。）。抗体等には原因はないでしょうか。（もともとIHCには使えない抗体とか。） 仮に賦活が必要だとして、 通常は剥離防止コートと書いてあるスライドガラスを使えば剥がれません。（普通のスライドグラスは剥がれてしまいます）コートの種類はいくつかありますが、どれも大差ないと思います。ただこれはパラフィン切片の場合で、凍結切片ではわかりません。 加熱は初めに賦活用溶液を一旦沸騰させてからスライドグラスを沈めて、そこから5~10min沸騰させます。今までいろいろな抗原抗体反応反応で賦活してきましたが、いずれも沸騰状態で5~10minで十分賦活できてます。なので30minは長すぎのように思います（賦活は短時間でも水が結構蒸発して液量が減るのでクエン酸の濃度が高くなるような気がするし）。時間を短縮することで剥離しなくなるかもしれません。抗原により適切な賦活条件はしばしば異なる場合もあります。剥離しやすさに影響あるかどうかわかりませんが、クエン酸buffer (pH6.0)でダメでも10mM Tris-HCl, 1mM EDTA (pH8.0-9.0)などの方だとうまくいく場合もあります。どちらもpHとキレート剤が重要です。

(無題) 削除/引用 No.12576-4 - 2024/09/17 (火) 19:09:36 - あああ しろろ様 MASコートスライドグラス（最近購入した使用期限内のもの）を使用しています。

(無題) 削除/引用 No.12576-2 - 2024/09/17 (火) 16:44:07 - しろろ スライドのコーティング剤は何を使っていますか？ 私の研究室ではAPSコートを使っていたのですが、厳しい賦活化条件を行いたくてMASコートのスライドにしたら解決しました。

凍結切片が剥がれてしまう問題について 削除/引用 No.12576-1 - 2024/09/17 (火) 16:08:08 - あああ いつもお世話になっております。 凍結切片が剥がれてしまう問題についてご意見をお聞かせください。 舌の免疫染色を行っているのですが、染色できませんでした。そこで賦活化(クエン酸で煮る)して免疫染色を行ってみようと思っているのですが、クエン酸で煮ている間に切片がスライドから剥がれてしまいます。 (現在行っている手順) ↓4%PFAで環流固定した後、マウスの舌を摘出し4%PFAで1h固定 ↓サンプルを凍結し、20μmで薄切 ↓約1h風乾 ↓10mMクエン酸ナトリウム溶液で賦活化(30min 沸騰した溶液中で煮る) 対策をご存知の方がいらっしゃいましたらご意見お聞かせください。 よろしくお願いします。

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