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(無題) 削除/引用 No.12570-13 - 2024/09/19 (木) 00:50:28 - おお >[Re:12] 384wellさんは書きました : > SDS-PAGEは滅多にしませんが、FACS、ELISA、RT-PCRなどは384-wellでやっています。 > スケールダウンの目的は培地などの試薬が高価なためです。 > 考えるところはスケールダウンしても検出感度を落としたり細胞の表現形を変えたりしないためにプロトコル最適化するところです。 > ありがとうございました。最適化に興味がありまして質問を立てた次第です。なにかアプローチの仕方で決まった道筋とか、苦労したところとか、どうしてもだめだった系とか開示できる程度で教えていただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.12570-12 - 2024/09/17 (火) 07:52:46 - 384well SDS-PAGEは滅多にしませんが、FACS、ELISA、RT-PCRなどは384-wellでやっています。 スケールダウンの目的は培地などの試薬が高価なためです。 考えるところはスケールダウンしても検出感度を落としたり細胞の表現形を変えたりしないためにプロトコル最適化するところです。

(無題) 削除/引用 No.12570-11 - 2024/09/14 (土) 06:11:53 - おお >[Re:10] ミニミニさんは書きました : > お高い細胞を96well plateで培養して、培養後に細胞数数えてFACS なるほど。プライマリーとか継代数が限られていて、その枠で使っていてなくなったら購入しないといけないような細胞なんですね。ちなみに浮遊細胞なのでしょうか？それなら９６とかでもあまり環境の変化で扱いにくくなるということはないのかな？

(無題) 削除/引用 No.12570-10 - 2024/09/14 (土) 00:39:23 - ミニミニ お高い細胞を96well plateで培養して、培養後に細胞数数えてFACS

(無題) 削除/引用 No.12570-9 - 2024/09/13 (金) 13:38:06 - おお >[Re:7] 1さんは書きました : > 細胞１個当たりのおおよそのタンパク質量とかRNA量とかはわかっているし、コンフレント時のwell あたりの大体の細胞数もいろんなところに出てるので、ど最小限でどのようなスケールならば自分の必要な量が確保できるかは計算で答え出ると思う。 加えていうと、RTPCRなら理論的には一つ細胞が有れば出来ますよね。

(無題) 削除/引用 No.12570-8 - 2024/09/13 (金) 13:19:25 - おお >[Re:7] 1さんは書きました : > 細胞１個当たりのおおよそのタンパク質量とかRNA量とかはわかっているし、コンフレント時のwell あたりの大体の細胞数もいろんなところに出てるので、ど最小限でどのようなスケールならば自分の必要な量が確保できるかは計算で答え出ると思う。 まあそうなんですけど、理論値だけでは語れませんよね。

(無題) 削除/引用 No.12570-7 - 2024/09/13 (金) 10:35:35 - 1 細胞１個当たりのおおよそのタンパク質量とかRNA量とかはわかっているし、コンフレント時のwell あたりの大体の細胞数もいろんなところに出てるので、ど最小限でどのようなスケールならば自分の必要な量が確保できるかは計算で答え出ると思う。

(無題) 削除/引用 No.12570-6 - 2024/09/13 (金) 10:21:06 - 独り言 高価な培地の時は、 dishのサイズは最低限はもちろんですが、培地量も規定の７割ほどに少なくしたりしてます。

(無題) 削除/引用 No.12570-5 - 2024/09/13 (金) 09:28:39 - おお >[Re:4] qqさんは書きました : > 培地がどの程度除去できてなくても構わないのかで、実現可能性が変わるだろうなと思います。 > SDS-PAGEのサンプルだとして、私は12-well plateでPBSを2回すすぎます。 > 10%FCS入の培地が残っていると困るなということであれば、仮にプレート遠心機があるとしても、96wellは選択肢に入りませんね。 > 質問者さんの場合は、そこはどうなのでしょうかね？ > 96でWBしたときはさほどFBSの混入が気にならないときやったことがあります。違う実験では９６でWellの培地をPBSで一度洗って、あたらしいPBSに変えてピペッティング細胞を剥がしマイクロチューブにいれて遠心して細胞を回収したりもしたことがあります（ただこのやり方は見る物によっては注意が必要と言うことは認識していますし、その実験ではそこまで問題がおこらないばあいということでやってます）。

(無題) 削除/引用 No.12570-4 - 2024/09/12 (木) 18:08:21 - qq 培地がどの程度除去できてなくても構わないのかで、実現可能性が変わるだろうなと思います。 SDS-PAGEのサンプルだとして、私は12-well plateでPBSを2回すすぎます。 10%FCS入の培地が残っていると困るなということであれば、仮にプレート遠心機があるとしても、96wellは選択肢に入りませんね。 質問者さんの場合は、そこはどうなのでしょうかね？

(無題) 削除/引用 No.12570-3 - 2024/09/12 (木) 15:16:52 - おお >[Re:2] あさんは書きました : > ９６まででしょう。３８４はハンドリングを考えると９６ｘ４の方が楽。 ハンドリングは確かにロボット使わないと大変かも知れません。逆に384でもロボっただったらいけそうだと言うことでしょうか？それなたどういう実験を想定しているのでしょうか？ > あとはその実験次第で、各自調整するしかないと思います。 確かに実験次第かなぁとと思うのですが、経験的に細胞、アッセイなど何か具体的な経験、話はないですか。漠然と実験次第かなぁと思うのですが、そういうことについて具体的な実験や話は無いですかというのが知りたい所、質問の趣旨でした。

(無題) 削除/引用 No.12570-2 - 2024/09/12 (木) 11:05:12 - あ ９６まででしょう。３８４はハンドリングを考えると９６ｘ４の方が楽。 あとはその実験次第で、各自調整するしかないと思います。

培養のスケールダウン 削除/引用 No.12570-1 - 2024/09/12 (木) 07:47:27 - おお 培養で何かを与えて蛋白、RNAなどを回収するとき６から２４ Well プレートとかよく使うと思います。培地自身が高いとか言うときは２４でやることも多いかと。あるいはプライマリーなどで得られる細胞数が限られているとか。 でも使う試薬などが高いときには更に小さい４８とかもっと小さいWellを使いたくなることもあると思います。皆さんは蛋白のSDSPAGEやRNAを回収してRTPCRなどのとき、どの程度まで小さいスケールでやってますか？蛋白なら９６Wellで１、２回は流せるのですが、普段あまり気にせずに増やせる細胞なら９６Wellも何かと使われますが、プライマリーとかになるとどうかとかもありますし、スケール変えることでの違いも気になるところです。さらに３８４になるとそうとできそうなことが限られるような気もします。 スケールダウンということで皆様のチャレンジや経験、考えるところなど教えていただけませんか？

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