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(無題) 削除/引用 No.12561-10 - 2024/09/09 (月) 15:43:09 - vegfr とりあえず、これ読んで見ましょう。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5582670/pdf/10.1369_0022155417724425.pdf マウスは人の30倍早く歳とるので、６ヶ月齢は6 month old x30=ヒトの180ヶ月齢＝１５歳 で　人間で言えば中３生くらいです。腸上皮の自家蛍光の起源ですが、リポフスチンが溜まるような年か？とも思いますので、たぶん好酸球ではと思います。

(無題) 削除/引用 No.12561-9 - 2024/09/09 (月) 12:21:21 - あの Tiyoは、どうなんでしょうね？メーカーに聞いたら、切片厚が10um以下という制限があって、照射時間も長いらしい。 当方の脳での実験では、グリシン法や、Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kitの組み合わせで十分と考えています。

(無題) 削除/引用 No.12561-8 - 2024/09/09 (月) 10:59:34 - う ＠all TiYOの自家蛍光消光装置についてですが、当方が学生であるため、ひとまずは試薬等でできる対応を探しています。試薬等で解決できないようでしたら検討してみます。提案していただきありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12561-7 - 2024/09/09 (月) 10:57:25 - う toto様 小腸に強い自家蛍光がでることは知りませんでした。ありがとうございます。また年齢によっても自家蛍光のレベルに変化があることについても知らなかったため勉強になりました。ありがとうございます。 使用しているマウスは生後5-6ヶ月のマウスを使用しているのですがこれは高齢マウスになるのでしょうか？知識不足で申し訳ございませんが教えていただけると幸いです。 true blackについてですが、以前ズダンブラックBで凍結切片の自家蛍光の抑制をしようとしたのですが、溶媒であるエタノールのせいで組織が収縮してしまい、綺麗な状態で観察できなかったため使用を諦めました。true blackは凍結切片でも使用できるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12561-6 - 2024/09/09 (月) 10:49:54 - う G25様 green,red,farredの波長で観察しましたがどの波長でも自家蛍光と思われるシグナルは確認できています。 添付資料もありがとうございます。確認させていただきます。 vegfr様 消化管粘膜で強い自家蛍光が観察されることは知りませんでした。ありがとうございます。 消化管の免疫染色を行う際は一般的には自家蛍光のクエンチング処理などは行われるのでしょうか？それともそれを超えるシグナルを検出することに力を入れますか？ご存じでしたらご教授願います。 凍結切片におけるズダンブラックB（SBB）を用いた自家蛍光の抑制は行ってみたのですが、SBBの溶媒であるエタノールのせいで組織が傷んでしまったためSBBの使用は諦めました。アルデヒドのクエンチングについては調べてみて試してみようと思います。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12561-5 - 2024/09/04 (水) 18:26:29 - ema https://nepagene.jp/products/fluorescent-stain-insituhcr/tiyo 切片を切って、Tiyoをして、免染をするというのはだめでしょうか。 まだ売り始めたばかりでデモしてもらえると思います。

(無題) 削除/引用 No.12561-4 - 2024/09/04 (水) 14:21:57 - toto 高齢になるほどリポフスチンのような組織の自家蛍光は強烈に出ますし、若くても、小腸では結構強い自家蛍光は出ます。自家蛍光の励起は幅広いので、それを利用して真のシグナルを検出する手もあって、私も以前は使ってましたが、どうしても画像的にいまいちになりがちです。他に、自家蛍光を消す試薬もいくつかでていて、たとえばBiotiumのTrueBlackはリポフスチンの蛍光を強烈に消してくれます。スダンブラックの改良版のような感じです。GFPの蛍光や免染の2次抗体の蛍光はあまり影響しません。ただ、一度、免染で狙った抗原のシグナルが消えたこともあり、オールマイティではないようです。 他には、強烈なLEDを数時間あてて消光させる装置もあります。これは波長を選べば、組織への障害は最小限にしてシグナルをはっきりさせることも可能です。一度メーカーから貸してもらって試してみればいいかもしれません。 ただ、組織では、GFPの蛍光を無理して検出してデータに使う必要もないわけで、抗GFP抗体を使って免染したほうがよい結果になりやすく、また自家蛍光への対策も楽になります。

(無題) 削除/引用 No.12561-3 - 2024/09/04 (水) 10:02:40 - vegfr 消化管粘膜はしばしば強い自家蛍光でます。その自家蛍光の変化を特殊な内視鏡で観察して病気の診断に利用したりとかの臨床の論文も見たことあります。自家蛍光は食物残渣中の成分とかコラーゲンとかNADPとかFADとかそういうのに由来するのかもしれません。 自家蛍光の抑制については古くはズダンブラックで処理とかいくつか方法はありますが、抑えられるレベルにも限度がありいつもうまくいくわけではありません。市販のブロッキング剤である程度の自家蛍光抑制効果があるものもある様です。アルデヒド系固定の場合、固定の後に残存するフリーのアルデヒドをグリシンなどでブロックするクエンティング処理を知ると自家蛍光をある程度弱めることができます（アルデヒドのクエンティングはグルタルアルデヒド固定の場合に行われますが、通常PFAの場合はあまり必要ないと言われていてしないことが多いですがやってみる価値はあると思います）。 そのほか、自家蛍光消光装置 TiYO という機器が販売されているようです。HPがある様なので一度チェックしてみてください。

(無題) 削除/引用 No.12561-2 - 2024/09/03 (火) 21:32:10 - G25 フィルターセットを変えて見てみましたか？ 特定の波長じゃなくて、不特定の波長でも見えるようなら、自家蛍光というより散乱かもしれません。 光ところに何か光を散乱させる構造や異物があるとか。 まじ自家蛍光ならこれが参考になるかと https://docs.research.missouri.edu/alm/autofluorescence.pdf

小腸凍結切片の自家蛍光対策 削除/引用 No.12561-1 - 2024/09/03 (火) 20:34:49 - う 初めて質問させていただきます。 現在、ある受容体を検出するために、GFP融合受容体発現TGマウスを用いてanti-GFPで小腸（凍結切片）の免疫染色をおこなっています。 anti-GFPで染色する前にポジコンの染色を行ったところ免疫染色のシグナルとは別に自家蛍光と思われるシグナルがまだらに上皮に現れました。 GFPの蛍光かと思い、ネガコンとしてWTマウスの染色なしの凍結切片を確認したところ同じ蛍光が確認できました。 自分の中ではPFAによる固定によって自家蛍光が見えてしまっているのではないかと考え、固定時間を調節してみましたが改善はありませんでした。 将来、GFP融合受容体を検出していく上で、現在見えている自家蛍光はノイズとなるため取り除きたいと考えています。 そこで質問なのですが、自家蛍光は通常現れるものなのか、自家蛍光に対する対策などご存じの方がいらっしゃいましたら教えてください。 固定条件は4%PFAで環流固定（10ml）と、摘出した小腸を切り開いた後に4% PFA,1 hの後固定です。 初めての質問で至らない点があるかと思いますが、ご存じの方がいらっしゃいましたら教えていただけないでしょうか？よろしくお願いします。

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