全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.12558-4 - 2024/09/05 (木) 11:35:37 - LPS アイディアを出していただきありがとうございます。 ターゲットは、組織の構造タンパク質に結合しているのと、S-S結合でつながっているようなので、十分に可溶化させるには、還元剤は不可欠なのと考えています。 そうですね、iodoacetamideもありですね。ただ、モノヨード酢酸の方が、溶解度が圧倒的に高いので、どちらも安い試薬ですし、試す価値はありそうです。 b-ME、パーセントでしか使ったことなかったので、初めてモル濃度を知りましたが、こんなに入れてたのかと驚きました。一方で、 14mMで抗体反応を阻害しなくなるとは知りませんでした。 透析や、カラムは、サンプル数が１００とかになるのと、回収率とかが関わってくるので、今のところは考えていません。

(無題) 削除/引用 No.12558-3 - 2024/09/03 (火) 14:28:49 - おお www.cellsignal.com/learn-and-support/protocols/protocol-ip-denatured?srsltid=AfmBOop6q6vVVadhlxdEj0DQ--u-ZJh4NIjbFDbPu6Kzj9DuSFaMC4A- これはIPのプロトコールですが、終濃度14mMで抗体を入れてます。IP lysis buffer でその程度の2MEを入れているプロトコールは見たことがあります。お示しの組成を考慮すると2MEは20倍希釈もすれば大丈夫そうですが、SDSが入っていていい系でも0.1%(triton x 100が1%ぐらい入っているバッファーで)ぐらいが上限なので100倍希釈しないといけないかな。 クラッシックな生化学的手法なら透析やゲル濾過があると思います。透析はカセット型やマイクロチューブ様のものが出回っていて、昔のチューブをクリップで止めるより簡単にセットできる様にはなってます。 例えば、www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/puralyzerminidialysiskit1234598765 (サンプルの容量に合わせて違うサイズのものがある) ゲル濾過だと、 www.agilent.com/store/productDetail.jsp?catalogId=1980-1103&catId=SubCat1ECS_4401778 みたいな感じのやつで、良くDNAからプライマーやdNTP を除くのに使われているやつで、G25や50、アガロースゲルが使われている。気を付けないといけないのはTEなどで平衡化されているので、先ずは置換したいバッファーで平衡しておく必要がある。あるいはフィルターカップを買って自分でゲルを入れてもいいかと。容量的には50ul程度を処理できるが、もう少しキャパが大きいプレパックで遠心や静置で滴下しでかいしゅうできるものもある(Cytiva Disposable PD-10 Columns、クロンッテクCHROMA SPIN)。 ただ、両者ともSDSを抜くのには不適です。 もう一つ出来そうなのはアセトンなどで一度タンパクを沈澱させるやり方ですが、再溶解でつまずくことが多いです。

(無題) 削除/引用 No.12558-2 - 2024/09/03 (火) 11:10:39 - toto ELISAで行う場合、還元剤だけでなくSDSも問題になりそうですが、大丈夫ですか？抽出操作に還元剤が必要なことはまずないので、除けばいいと思いますが。もし還元剤をどうしても使いたくて、あとで消したいのであれば、iodoacetic acidではなくiodacetamideが簡単です。ただその場合も、2.5％bMEだと濃度が高すぎるので、還元剤を10mM DTTにして、あとで25mMiodoacetamideを加えれば消せます。これがELIZAに影響する場合はあまりないのではないかな。 SDSはやっかいですが、そのELIZAへの影響を調べて、影響ないくらいまで下げるのが現実的でしょう。

サンプル中の還元剤の不活化 削除/引用 No.12558-1 - 2024/09/03 (火) 10:44:45 - LPS 組織中のあるターゲットの濃度を測定したいのですが、組織からの抽出は10%SDS-2.5%bMEで行う必要があります。このサンプルをウェスタンで測定することいのですが、感度、サンプル数の事情で、ELISAに系を移したいと考えています。しかし、抽出液の組成、特にbMEの存在が障害になると考えています。このサンプル液中のbMEを手軽に失活させる方法はあるでしょうか？モノヨード酢酸とかも考えたのですが、どうでしょう？ 理想的には失活後、透析などせずにそのまま(希釈は可)ELISAに持ち込めたら完璧です。 どうかお知恵をお貸しください。 必要なサンプル量は50-100ulですが、bMEは2.5%で0.32MになるとchatGPTが計算してくれました。

全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---