BioTechnicalフォーラム [サブクローニング用の大腸菌が全く増えません]

サブクローニング用の大腸菌が全く増えません

No.12557-TOPIC - 2024/09/03 (火) 10:30:29 - S.H

現在遺伝子の研究でサブクローニングを行っているのですが、サブクローニング用の大腸菌が全く増えません。大腸菌はTOYOBOさんのCompetent Quick DH5α、培地はプラスグロウⅡとBacto Agarにアンピシリンを混ぜたものを使用しています。インキュベートは37℃で一晩置いています。
ライゲーションとトランスフォーメーションが原因かと思い、冷凍庫から取り出した大腸菌をそのまま培地に塗布したのですが、増えませんでした。
有識者の方、何か問題点などが分かればご教授いただければ幸いです。
　

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No.12557-7 - 2024/09/03 (火) 15:17:50 - おお

この手の実験は結構確認するべきステップが多いので、掲示板とかで簡単に解決できる問題出なかったりもする。

ただ指摘にある耐性をまかないと生えないのは事実です。で無傷のプラスミドを使えばいいわけですが、この時プラスミドの量を良く考えてください。10ng使ったらどれくらいコロニーができますか？期待通りの数が得られなかったらどこか悪いところがあることにあると思われます。

関連して、ligation product の形質転換をするとligation がうまくいってなくても、バックグラウンドのコロニーがいくらか生えることが大抵です。これも情報としては大事なことです。使ったプラスミドが傷だらけだったとかUV照射が過剰だったとかコンピテントの効率が悪かったとか(市販のものを使っているのでちゃんとストックしていれば今回の場合は問題はないと思うけど)。これはないと思うけど、カナマイシン耐性プラスミドをアンプで選択していると言う事も稀に見られる。

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No.12557-6 - 2024/09/03 (火) 14:31:49 - S.H

独り言さん、G25さんありがとうございます！
無傷のプラスミドベクターで実験してみます。
また結果出たら報告しに来ます。

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No.12557-5 - 2024/09/03 (火) 14:08:52 - G25

>冷凍庫から取り出した大腸菌をそのまま培地に塗布したのですが、増えませんでした。

薬剤耐性プラスミドを持たない大腸菌を選択培地に蒔いたらそうなりますよね。

>トランスフォーメーションはライゲーション産物を使って行いました。それでも増殖は見られなかったです。

ライゲーションがうまくいっていない可能性もあるのだから、無傷のプラスミドベクターで対照実験しなさいと言われてるんですよ。

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No.12557-4 - 2024/09/03 (火) 13:36:12 - 独り言

とりあえず、プラスミドを0.1ugでもいいので直接トラフォメして、数えきれないほどコロニーができれば、コンピは問題ないかと思います。

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No.12557-3 - 2024/09/03 (火) 13:14:49 - S.H

返信していただきありがとうございます。
調べてみたところ、耐性がない大腸菌をampプレートに撒いてしまっていたみたいです。

トランスフォーメーションはライゲーション産物を使って行いました。それでも増殖は見られなかったです。

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No.12557-2 - 2024/09/03 (火) 11:08:15 - 独り言

冷凍庫から取り出した大腸菌というには、アンピシリン耐性の大腸菌をampプレートに撒いたということですか？それとも耐性のない大腸菌を抗生物質ないプレートにも生えないということ？

またトラフォメは、ライゲーション産物でなく、プラスミドをトラフォメしても全く生えないということでしょうか？