Bio Technical フォーラム

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No.12547-14 - 2024/09/02 (月) 12:47:53 - あの
より詳しい方が意見をくれるまでの、場繋ぎでしかできませんが、、、

当方は、最初の質問に書かれた全部で１３色というのは、無理じゃないかと感じます。

その後に、例であげた６色というのはよく考えられているけれども、このくらいの色数がFCMの場合には限界のように感じます。また例の中の６色も、実施できるのは一部の機種のみによるのではないかと思います。

もしかしたらFACSして、再度染色しなおすようなことをすれば、色数を多少だけ増やせるかもしれませんが、実施した経験はありません。


とはいえ、より詳しい方の御意見を当方もうかがいたいです。

もし既にメーカー等に確認して、１３色できるという回答を得ているならば、お恥ずかしい限りですが、既に考えられているようなこと以上のことは思いつかないです。

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No.12547-13 - 2024/09/01 (日) 23:29:26 - 白風呂
>[Re:12] あのさんは書きました :
> 擬似カラーだけど。
はい。で、マルチカラー解析をするときの蛍光色素を選ぶポイント、考え方がありましたら教えていただけますと助かります。

(無題) 削除/引用
No.12547-12 - 2024/09/01 (日) 15:28:23 - あの
擬似カラーだけど。

(無題) 削除/引用
No.12547-11 - 2024/08/31 (土) 22:20:29 - 白風呂
ちなみに、
>[Re:9] PICさんは書きました :
> まあ、ボスに精一杯多色で染めろと言われているのなら投稿主さんには同情します。
そうですか？こちらは結構ウキウキですよ。何色に染めようか考えています。

(無題) 削除/引用
No.12547-10 - 2024/08/31 (土) 22:16:32 - 白風呂
>[Re:9] PICさんは書きました :
> あと、PBMCと書いているので密度分離するのだとおもいますが、まずFicollなどヒト用の分離液はマウスには不適でマウス用のものが必要なことは大丈夫でしょうか？
なるほど。考慮します。

ヒトでもマウスでもいいのですが、血液細胞が充分にとれたとして、多重染色をする場合の色素の選び方はいかがでしょうか？使用機器も開示しましたが。

(無題) 削除/引用
No.12547-9 - 2024/08/31 (土) 13:58:59 - PIC
まあ、ボスに精一杯多色で染めろと言われているのなら投稿主さんには同情します。多色解析が可能となったのはフローサイトメトリーの進化だけではだめで、新規蛍光色素の登場が必要でした。そして今も日々新しいものが出てきています。それらは抗体会社占有のものが多く、同一会社内の組み合わせであれば先に書いたMulticolor Panel Builderで色素組み合わせの正当性を担保できますが、複数会社の色素を組み合わせるのは自分でスペクトルを見て判断するのは責任がかかってきますからね。会社側からすれば今は囲い込み競争中という感じでしょう。
あと、PBMCと書いているので密度分離するのだとおもいますが、まずFicollなどヒト用の分離液はマウスには不適でマウス用のものが必要なことは大丈夫でしょうか？そして、PBMC分離したときの回収率はよくないことも考慮する必要があります。マウスのwhite bood cellは2x10(6)-1x10(7) cells/ml、lymphocyteはこのうち70-80%です。どれくらいの血液から測定するのでしょうか？

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No.12547-8 - 2024/08/31 (土) 03:45:36 - 白風呂
例えば、（少々長くなるかと思いますがご容赦願います。）今、教科書を見ているのですが、ヒト単核球を6色で解析した場合、
レーザーが3本、
488nmで FITC-CD16、PE-CD56、PE-Texas Red-CD8
633nmで APC-Cy7-CD19、APC-CD3
407nmで Cascade Blue-CD4
これで解析されています。検出細胞はT、B、NK細胞です。例えばターゲットの細胞腫によってレーザーを分けて検出したほうがいいとか、なにか工夫があるのでしょうか？
この例でいきますと例えばT細胞マーカーのCD3が633nmで、さらにhelperとcytotoxic Tを分けるときは違うレーザーがいいとか、フィルターのwavelengthがはなれていたほうがいいとか、何か検出する際の組み合わせで考えたほうがいいことってあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.12547-7 - 2024/08/31 (土) 03:12:54 - 白風呂
>[Re:6] あのさんは書きました :
> 念のためですが、コンペンセーションなど、基本的な知識はありますね？
> 　https://pdbu-support.bio-rad.co.jp/fcguide/0205.html
あります。

> 色数が多くなるほど、難しくなる。既に出ている助言も踏まえて、まず少なめの色数で試してみたらどうですか？
それは考えておりません。

(無題) 削除/引用
No.12547-6 - 2024/08/31 (土) 02:41:30 - あの
念のためですが、コンペンセーションなど、基本的な知識はありますね？
　https://pdbu-support.bio-rad.co.jp/fcguide/0205.html

色数が多くなるほど、難しくなる。既に出ている助言も踏まえて、まず少なめの色数で試してみたらどうですか？

(無題) 削除/引用
No.12547-5 - 2024/08/30 (金) 22:55:45 - 白風呂
>[Re:3] あさんは書きました :
> せめてFACSの機種くらいは書きましょう`
Cytek Aurora か、BD FACSymphony A3 かを使うかと思います。

色素の組み合わせ選びで注意することはありますでしょうか？きちんと分けて検出できればどの色素でもあまり気にすることでもないでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.12547-4 - 2024/08/30 (金) 22:47:18 - 白風呂
>[Re:2] PICさんは書きました :
> マウスのPBMCで小集団までを解析できるほどの細胞数を用意するのは大変な気がしますが・・・、
そこは私も懸念しておりましたが、やはりそうでしょうか。予備実験はするつもりですので確認します。
> 本題のマルチカラーでの抗体セットを選ぶツールとして、例えばBioLegend webのsupportからMulticolor Panel Builderのsuggestionを参考にするのも手かと思います。Thermoにも同様のツールはあるようですね。
初めて知りました。ありがとうございます。参考にします。

>[Re:3] あさんは書きました :
> 蛍光標識抗体を一から買い揃えるような前提の書き方ですが、
一から買いそろえるため、どのように色素を組み合わせるのがいいのかをうかがいました。

> せめてFACSの機種くらいは書きましょう`
機種を開示することで蛍光色素の組み合わせの選び方の具体的なアドバイスをいただけるのでしょうか？確認してみます。少々お待ちを。

(無題) 削除/引用
No.12547-3 - 2024/08/30 (金) 14:42:08 - あ
蛍光標識抗体を一から買い揃えるような前提の書き方ですが、すでにラボにある蛍光標識抗体を組み合わせて染めることが多いし、FACS用の標識蛍光色素の種類もそんなにある訳ではないですから、

手持ちにない染色用抗体を、余っている検出器に割り当てて買いましょう。
そうやっていくと、そんなに選択肢はないと思います。


せめてFACSの機種くらいは書きましょう`

(無題) 削除/引用
No.12547-2 - 2024/08/30 (金) 14:00:26 - PIC
マウスのPBMCで小集団までを解析できるほどの細胞数を用意するのは大変な気がしますが・・・、
本題のマルチカラーでの抗体セットを選ぶツールとして、例えばBioLegend webのsupportからMulticolor Panel Builderのsuggestionを参考にするのも手かと思います。Thermoにも同様のツールはあるようですね。

フローサイトメトリー マルチカラー解析 蛍光色素を選ぶポイント 削除/引用
No.12547-1 - 2024/08/30 (金) 07:44:22 - 白風呂
マウスの全血からPBMCを取って、生細胞をゲーティングしてCD45+でLeukocyte、CD11b+でMyeloid、LymphoidをゲーティングしてT、NK、NKT、MDSC細胞などを解析しようと思います。（B細胞はなし。）
ターゲットの抗原はある程度決めてあります。最初の生死ゲートを含めて13色くらいになろうかと思います。このくらいの種類の解析を一度にやる場合、どのようなことに留意でして蛍光色素を選ぶといいでしょうか？「発現の弱い抗原に対してより明るい蛍光色素を用い、発現の強い抗原に対して弱い蛍光色素を用いる」というのはイメージできます。生死細胞の選択はPIにいい思い出がないためFixable Viability Dyeを使う予定です。
マルチカラー解析をするときの蛍光色素を選ぶポイント、考え方がありましたら教えていただけますと助かります。よろしくお願いします。
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