全34件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

(無題) 削除/引用 No.12547-34 - 2024/09/04 (水) 22:45:20 - 白風呂 >[Re:33] PICさんは書きました : > 多分、質問者さんの言いたいことは、「スピルオーバーがある蛍光色素のペアを考えた時、同じ細胞が発現している高発現分子と低発現分子に振り分けるよりは、強発現かつpositive/negativeポピュレーションにはっきり分かれるようなマーカー分子に割り当てた方がいいですよね？」ということでしょうか。それならば確かに考慮できるに越したことはないと思います。 （スピルオーバー？？）・・・そ、そう、そういうことです。どう考慮したほうがいいでしょうかね？ > ところで、今まで全体にコンベンショナルなフローサイトメータ−をイメージして私も含めて書かれてきた感じが強いですが、実はCytec Auroraが今後安定して（予約競争とかなく）使えるのならば、 なるほど。せっかくですのでCytec Auroraの使用を検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.12547-33 - 2024/09/04 (水) 17:10:40 - PIC > ターゲットによってレザーとか変えたほうがいい 多分、質問者さんの言いたいことは、「スピルオーバーがある蛍光色素のペアを考えた時、同じ細胞が発現している高発現分子と低発現分子に振り分けるよりは、強発現かつpositive/negativeポピュレーションにはっきり分かれるようなマーカー分子に割り当てた方がいいですよね？」ということでしょうか。それならば確かに考慮できるに越したことはないと思います。 ところで、今まで全体にコンベンショナルなフローサイトメータ−をイメージして私も含めて書かれてきた感じが強いですが、実はCytec Auroraが今後安定して（予約競争とかなく）使えるのならば、Cytec Aurora専用の抗体・色素として、それこそ明るそうなものを適当に見繕ってしまえばよいだけなのかもしれません。スペクトルアナライザのすべてのレーザーからの蛍光をスペクトル分解して元の蛍光分子からの強度を再構成してしまう解析能力は驚異的です。たとえば、APCとAF647を区別できるとかですね。これが使える環境にいるのは素晴らしいこととだと思います。もっとも、私は使ったことがないので細かいことはわかりませんが・・・。

(無題) 削除/引用 No.12547-32 - 2024/09/03 (火) 22:37:17 - 白風呂 >[Re:30] けけけさんは書きました : > コメントに対するレスポンスがあまりに初心者すぎて、実験手引き書を一度読んでから出直した方が良い。 ぜひご意見を聞かせてください。ターゲットによってレザーとか変えたほうがいいですか？ > ほんとに論文は漁ったのかな？ まだ漁っておりません。

(無題) 削除/引用 No.12547-31 - 2024/09/03 (火) 22:34:36 - 白風呂 >[Re:29] PICさんは書きました : > > そこまで気にするまでもないでしょうか。 > 新規蛍光色素の特性は情報が少なく、色素同士の変な相互作用があってアーチファクトが出てもその時の染色プロット単独からおかしいと見抜くことは難しいと思います。別の時にした結果あるいは報告のある結果と染色パターンが一致しないとかをきっかけに、別の抗体・色素の組み合わせを試みて同じになるか探るしかないと思います。ほかにも広く使われていないクローンでは、このクローンの染色ホント？疑惑も出たりして、グダグダすることはみなさん、ままあるのではと思います。 なるほど。ではメジャーに使われていそうな抗体を探します。

(無題) 削除/引用 No.12547-30 - 2024/09/03 (火) 20:22:30 - けけけ コメントに対するレスポンスがあまりに初心者すぎて、実験手引き書を一度読んでから出直した方が良い。 ほんとに論文は漁ったのかな？

(無題) 削除/引用 No.12547-29 - 2024/09/03 (火) 17:27:53 - PIC > そこまで気にするまでもないでしょうか。 新規蛍光色素の特性は情報が少なく、色素同士の変な相互作用があってアーチファクトが出てもその時の染色プロット単独からおかしいと見抜くことは難しいと思います。別の時にした結果あるいは報告のある結果と染色パターンが一致しないとかをきっかけに、別の抗体・色素の組み合わせを試みて同じになるか探るしかないと思います。ほかにも広く使われていないクローンでは、このクローンの染色ホント？疑惑も出たりして、グダグダすることはみなさん、ままあるのではと思います。

(無題) 削除/引用 No.12547-28 - 2024/09/03 (火) 13:48:51 - 白風呂 >[Re:26] PICさんは書きました : > 一般論として語るのは問題ありなのですが、 > ・保存安定性がよくないことがある。特にスペクトルが変化するのは困りもの。これについては代替色素が出た時に既存の色素と比較したデータが出ている場合もある。 > ・Monocyte系の細胞への非特異的結合が見られることがある。これを抑制するMonocyte Blockerというものも存在はして、確かに有効ではある。 > ・他の色素を持つ抗体と相互作用することがある。これは、特定のクローン・蛍光色素のペアで見られるもので、必ずしも起きるわけではないが、ある程度のルールはあるようである。ただし、私は会社に属するので勝手には公表はできないです。 > ・吸収が２ピークあり、他軸光学系にもシグナルを入れる。もっとも、補正できないわけではない。 なるほど。とても参考になります。吸収ピークが二つであったり、広いですよなとは思っていました。複数のレーザーや蛍光を使う場合は留意しないとですね。「相互作用のある程度のルール」というのは気になりますが、そこまで気にするまでもないでしょうか。 >[Re:27] PICさんは書きました : > > 本当に何色でもいいのであれば > わざと極解して書いているのかもしれませんが、先に上げた抗体会社のテクニカルな解説にあるように、蛍光色素の明るい・暗いの差はかなりのもので、これにターゲット分子の発現量の予想を加味して決める必要がありますよ。CD3、CD16、CD4、CD8、CD19、CDはみんなブライトマーカーだから何でもよかっただけです。なんか、そんなの当たり前でしょと返されそうですが・・・ 発現量に合わせて蛍光色素の明るさは考慮に入れようと思います。

(無題) 削除/引用 No.12547-27 - 2024/09/03 (火) 13:30:35 - PIC > 本当に何色でもいいのであれば わざと極解して書いているのかもしれませんが、先に上げた抗体会社のテクニカルな解説にあるように、蛍光色素の明るい・暗いの差はかなりのもので、これにターゲット分子の発現量の予想を加味して決める必要がありますよ。CD3、CD16、CD4、CD8、CD19、CDはみんなブライトマーカーだから何でもよかっただけです。なんか、そんなの当たり前でしょと返されそうですが・・・

(無題) 削除/引用 No.12547-26 - 2024/09/03 (火) 13:02:40 - PIC 一般論として語るのは問題ありなのですが、 ・保存安定性がよくないことがある。特にスペクトルが変化するのは困りもの。これについては代替色素が出た時に既存の色素と比較したデータが出ている場合もある。 ・Monocyte系の細胞への非特異的結合が見られることがある。これを抑制するMonocyte Blockerというものも存在はして、確かに有効ではある。 ・他の色素を持つ抗体と相互作用することがある。これは、特定のクローン・蛍光色素のペアで見られるもので、必ずしも起きるわけではないが、ある程度のルールはあるようである。ただし、私は会社に属するので勝手には公表はできないです。 ・吸収が２ピークあり、他軸光学系にもシグナルを入れる。もっとも、補正できないわけではない。

(無題) 削除/引用 No.12547-25 - 2024/09/03 (火) 12:09:33 - 白風呂 >[Re:16] PICさんは書きました : > あと、タンデムダイは問題を起こしやすいので避けたいな、と思いました。 これはちょっと伺いたいです。タンデムダイはやめたほうがいいですか？どんな問題がありましたか？

(無題) 削除/引用 No.12547-24 - 2024/09/03 (火) 11:45:46 - 白風呂 >[Re:23] うさんは書きました : > 選んだ抗体のクローンによっても全然変わるし、 そんなに変わりますか？何が変わります？ > 染める時の抗体濃度でもある程度はコントロールできるので、 > とはいえ本当にいちからランダムに自分で買い揃えるとトラブルシュートというか条件決めをやらないといけないので、 条件っていちいち決めますか？もうその抗体会社が推奨している濃度でやるつもりです。 > 論文を漁って、それと同じ抗体クローンの組み合わせでやるのがいいように思いました 彼らはどうやって決めたのかな、と。

(無題) 削除/引用 No.12547-23 - 2024/09/03 (火) 11:33:46 - う 細かい考え方、例えば励起を別のレーザーにした方が解析しやすいとか、コンペんセーションしやすい色素の組み合わせとかはあるのですが、選んだ抗体のクローンによっても全然変わるし、染める時の抗体濃度でもある程度はコントロールできるので、絶対的な考え方というか王道みたいなのはないです。 とはいえ本当にいちからランダムに自分で買い揃えるとトラブルシュートというか条件決めをやらないといけないので、普通はラボにある染色濃度がわかっている抗体を使って足りない分を買い足していくのですが、論文を漁って、それと同じ抗体クローンの組み合わせでやるのがいいように思いました

(無題) 削除/引用 No.12547-22 - 2024/09/03 (火) 11:05:28 - 白風呂 本当に何色でもいいのであれば解析機器とフィルターに合わせてターゲットのCD低番号から高番号まで一列に並べて低波長から高波長までの色素をリストアップして買ってもいいかな、くらい考えていたのですが、さすがによくないのかな、何か考え方があるのかなと思って伺いました。

(無題) 削除/引用 No.12547-21 - 2024/09/03 (火) 10:54:31 - 白風呂 >[Re:20] うさんは書きました : > 抗原と抗体と蛍光色素の組み合わせが多くて決められない、ということのようですが、参考にしようとしている論文はどれか教えてもらえますか。 > > 考え方や選び方と言っても、一から自分で買いそろえたり試すことは少なく、何かしらの論文を追試していくことが多いです。 参考にしている論文は今のところありません。上司から実験計画を聞いて、実際にどうやって実験を進めようか考えていく中でこのような疑問が出たのでまずこちらで伺いました。これから似たようなターゲットを多重染色している論文をあさって参考にしようかなと思っているところです。

(無題) 削除/引用 No.12547-20 - 2024/09/03 (火) 10:40:14 - う 抗原と抗体と蛍光色素の組み合わせが多くて決められない、ということのようですが、参考にしようとしている論文はどれか教えてもらえますか。 考え方や選び方と言っても、一から自分で買いそろえたり試すことは少なく、何かしらの論文を追試していくことが多いです。

(無題) 削除/引用 No.12547-19 - 2024/09/02 (月) 23:58:45 - 白風呂 ちなみに、 >[Re:16] PICさんは書きました : > 余分なことは聞きたくなさそうですが、 余分なことを聞きたくないというよりは検出したいターゲットに対して蛍光色素はどうやって選ぶのかなということを聞きたかったということです。 > 勝手に感想を書かせてもらうと・・・、PE-Texas Red, Cascade Blueなんてマイナーなのはわざわざ選びたくないな（市販FACS抗体であるの？）、そもそもフィルター合うのかなと。 いくらでもありますし、もちろんフィルターに合うのを選びますよ。 > あと、タンデムダイは問題を起こしやすいので避けたいな、と思いました。 問題とは？ >[Re:14] あのさんは書きました : > もしかしたらFACSして、再度染色しなおすようなことをすれば、色数を多少だけ増やせるかもしれませんが、実施した経験はありません。 FACSして、再度染色しなおす？

(無題) 削除/引用 No.12547-18 - 2024/09/02 (月) 17:26:50 - PIC ちょっと訂正 > 光学系で重なるのはFITC-PE すいません。Texas RedもPEタンデムでしたね。 すると、488 nmでFITC-PE-PE/Texas Redの３色かもですね。 561 nmレーザーがあればPEおよびPE-Texas Redはこちらに。

(無題) 削除/引用 No.12547-17 - 2024/09/02 (月) 15:50:52 - 白風呂 >[Re:16] PICさんは書きました : じゃぁまぁ基本的には検出器に合っていればどの組み合わせでもそれほど気にしなくても大丈夫そうですかね。いろいろと検索にかけてもそれらしい情報が見当たらなかったので、実際にやられている人は何か工夫があるのかなと思ったのですが、気にしすぎだったかもしれません。いろいろとご心配ありがとうございます。 他の経験者の方でも色素選びに工夫されているかたがいらしたらコメントいただければと思います。

(無題) 削除/引用 No.12547-16 - 2024/09/02 (月) 15:06:43 - PIC >FITC、PE、PE-Texas Red、APC-Cy7、APC、Cascade Blueの6種類 この色素の縛りがあるとして、CD3、CD16、CD4、CD8、CD19、CD５への割り当ては、細胞の種類で云々はたぶん理屈が付かないと思うので、自由にしていいと思います。すべて多発現マーカー分子ですし、光学系で重なるのはFITC-PE (機種によってはこれも別軸)とAPC-APC/Cy７だけで困難はなさそうです。 まとまった情報として、例によってBioLegend webをみると（他社にもその手の説明ページはある）Multicolor Staining Guideというのがありますが、まあ常識内の内容と思うことでしょう。あとは個別に発生するトラブルシューティングになります。 余分なことは聞きたくなさそうですが、勝手に感想を書かせてもらうと・・・、PE-Texas Red, Cascade Blueなんてマイナーなのはわざわざ選びたくないな（市販FACS抗体であるの？）、そもそもフィルター合うのかなと。あと、タンデムダイは問題を起こしやすいので避けたいな、と思いました。

(無題) 削除/引用 No.12547-15 - 2024/09/02 (月) 13:32:30 - 白風呂 >[Re:14] あのさんは書きました : > その後に、例であげた６色というのはよく考えられているけれども、 では6色でやるとして、先ほどの例と合わせて、 検出したいターゲットが CD3、CD16、CD4、CD8、CD19、CD56の6つ、 蛍光色素をFITC、PE、PE-Texas Red、APC-Cy7、APC、Cascade Blueの6種類で検出出来る機器を使うとして、 抗体を買う際にそのターゲットと蛍光色素の組み合わせはどうやって決めるのでしょうか？何か組み合わせの考え方はあるのでしょうか、別に何でもいいのか、わかるかたはいらっしゃいますか？

全34件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---