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(無題) 削除/引用 No.12515-5 - 2024/08/16 (金) 21:15:06 - tato おおさん メカニズムを考えると確かにそうですね。考えが足りなかったです。参考文献ありがとうございます。 >[Re:4] おおさんは書きました : > https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.95.23.13670 > > ここのFigure 5とか、濃度依存的に強さがわかってますけどね。 > > 化学平衡を考えるとTetの濃度でTetが結合しているtTAの濃度が決まるわけで、それによってtTAとゲノムの結合の平衡も変わるのだから完全にONかOFFというのはありえないと思います。ただアフィニティーの強さなどによってはそのウインドーが狭いかもしれません。 > > ＞低発現をしたい際にはどのくらいの濃度がいいのか > あなたの扱う蛋白の安定性なども考慮にいれると他の実験がどれくらい当てになりますでしょうか。低発現をどの程度の量を考えているのかにもよるでしょうし。200mg/kgが飽和状態の濃度であるなら飽和状態より低い値になるのがどの濃度かというのもありますけど。確か細胞レベルの実験で濃度を１０分の１ぐらいにして半分程度っていうのは見たことあるような。3.3倍ぐらいで量をふってみてもいいかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.12515-4 - 2024/08/16 (金) 04:33:54 - おお https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.95.23.13670 ここのFigure 5とか、濃度依存的に強さがわかってますけどね。 化学平衡を考えるとTetの濃度でTetが結合しているtTAの濃度が決まるわけで、それによってtTAとゲノムの結合の平衡も変わるのだから完全にONかOFFというのはありえないと思います。ただアフィニティーの強さなどによってはそのウインドーが狭いかもしれません。 ＞低発現をしたい際にはどのくらいの濃度がいいのか あなたの扱う蛋白の安定性なども考慮にいれると他の実験がどれくらい当てになりますでしょうか。低発現をどの程度の量を考えているのかにもよるでしょうし。200mg/kgが飽和状態の濃度であるなら飽和状態より低い値になるのがどの濃度かというのもありますけど。確か細胞レベルの実験で濃度を１０分の１ぐらいにして半分程度っていうのは見たことあるような。3.3倍ぐらいで量をふってみてもいいかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.12515-3 - 2024/08/15 (木) 20:51:45 - tato AAさん、 貴重な情報ありがとうございます。 一方で自分の作ったコンストラクトの評価を培養細胞でしてみると、濃度依存的にONになる細胞のディッシュ全体での比率は変化します。 このことをもう一度確認させていただきたいのですが、低濃度のDOXで培養し免疫染色などを行うとONになっている細胞とOFFになっている細胞が混じっているということでしょうか？私の期待では、低濃度のDOXではすべての細胞が低発現になるのかと思っていました。 >[Re:2] AAさんは書きました : > Tet-OFFシステムに使われるTRE配列はCMVのminimal promoterを含んでおり、その前にtetO配列リピートが挿入されています。 > tetO配列へリクルートされたtTA分子中のVP16ADがCMV minimal promoterに作用して発現誘導となるので、発現する場合は高い発現量となるのではないかと思います。 > 一方で自分の作ったコンストラクトの評価を培養細胞でしてみると、濃度依存的にONになる細胞のディッシュ全体での比率は変化します。単一細胞内での発現量は先述の通りですが、組織全体での発現量はDOX濃度で制御を試みる事はできるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12515-2 - 2024/08/15 (木) 09:13:36 - AA Tet-OFFシステムに使われるTRE配列はCMVのminimal promoterを含んでおり、その前にtetO配列リピートが挿入されています。 tetO配列へリクルートされたtTA分子中のVP16ADがCMV minimal promoterに作用して発現誘導となるので、発現する場合は高い発現量となるのではないかと思います。 一方で自分の作ったコンストラクトの評価を培養細胞でしてみると、濃度依存的にONになる細胞のディッシュ全体での比率は変化します。単一細胞内での発現量は先述の通りですが、組織全体での発現量はDOX濃度で制御を試みる事はできるかもしれません。

mouseでのTet-OFF system 削除/引用 No.12515-1 - 2024/08/15 (木) 04:31:19 - tato 現在、マウスでの試験を計画しているのですが、このマウスは２つのlineを掛け合わせたtet-off systemを採用しています。そのため、産まれた時からdoxycyclineを含む餌を与えておりますが、ある時点でdoxycyclineを餌からぬくことによって目的の遺伝子が発現するようにしております。このシステムは名前の通りON or OFFと思っていたのですが、もし餌に含まれるdoxycyclineの濃度を低くすると低発現を実現できるのでしょうか？計画では200mg/kgのdoxycyclineを含む餌をはじめに与える予定ですが、もし低発現をしたい際にはどのくらいの濃度がいいのか、もし経験があったり、ご存じのようでしたらぜひ教えてください。よろしくお願いします。

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