BioTechnicalフォーラム [ゲル精製効率が10%しかない]

ゲル精製効率が10%しかない

No.12513-TOPIC - 2024/08/14 (水) 20:35:55 - ゲル

アガロースゲルから切り出した約9kbのPCRフラグメントをプロメガのゲル精製キットを使って精製すると、収率が10%程度にしかなりません。ウォッシュバッファーにはエタノールが正しく入っており、ゲルは55℃で完全に融解しています。メーカーのトラブルシューティング例に倣って最後の溶出を50℃の水でやりましたが改善しませんでした。何度やっても、誰に見てもらっても改善しません。アドバイスをいただけますと幸いです。
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System
　

- このトピックにメッセージを投稿する -

全10件 ( 1 ～ 10 )　前 | 次　1/ 1. /1

(無題)

削除/引用

No.12513-10 - 2024/08/15 (木) 13:33:10 - おお

>[Re:8] おおさんは書きました :
> >[Re:6] EMSさんは書きました :

>
> 吸光光度計の検出限界は大体数ng/ulぐらい。例えば１ng/ulの濃度のDNAを１０ul電気泳動で流せばバンドが見れると思う。
>

因みにに電気泳動の蛍光色素によってはもっと感度が高い可能性もある。

(無題)

削除/引用

No.12513-9 - 2024/08/15 (木) 11:25:51 - G25

>260のところのピークはなくなります。メーカープロトコールでは収率95%と書いてあります。何かご必ずおかしいです。

おおさんの話がピンときていないようで。

dNTPもprimerも260 nmに吸光があります。
DNAに260 nmの吸光があるのは、個々のヌクレオチドに260 nmに吸光があるからこそということはわかっているかな？

PCR反応液にはたっぷりのdNTPとprimerが入っています。
dNTPとプライマーだけでたっぷりのOD260がでます。
DNAに合成されるのはその一部だけです。
精製して遊離のdNTPやprimerが除去されたためOD260値が下がった、ピークが下がったという当然の結果に見えます。

メーカーがやっている回収率の評価はおそらく既知量のDNAをカラムにかけて溶出して求めているはずです。あるいはQuantusとかQubitのようなインターカレータをもちい蛍光強度で二重鎖DNA特異的に定量する系かも。

精製前後で泳動するというのはやってないのでしょうか。
吸光度ではわからない定性的（目的のサイズのシングルバンドか副産物やスメアが認められるかなど、定量的（EtBtなどなら二本鎖DNAが選択的に染まるのでバンド強度で量が見積もれる。遊離のdNTPやprimerの影響を受けない）な情報が得られます。
少なくとも経験が乏しく、毎回安定的な結果が出ていてルーチン化していないうちは泳動はやるべき。

ところで、実際の定量値はどれくらいだったんでしょうか。
精製前は収量10 ug以上とか、one tubeのPCRでは常識的にはありえないとんでもなく大きな値だったりしませんか。

(無題)

削除/引用

No.12513-8 - 2024/08/15 (木) 00:12:27 - おお

>[Re:6] EMSさんは書きました :
> 260のところのピークはなくなります。メーカープロトコールでは収率95%と書いてあります。何かご必ずおかしいです。

で、精製前のPCRフラグメントの見積もりは？
dNTPやプライマーが入ってるから２６０では測れない。１０％をどうやって計算しているか。
実際電気泳動して精製まえと精製後で比べたのならわからなくないけど。

吸光光度計の検出限界は大体数ng/ulぐらい。例えば１ng/ulの濃度のDNAを１０ul電気泳動で流せばバンドが見れると思う。

プロメガのやつたまに使うけど回収率で困ることは今までなかったけどね。

(無題)

削除/引用

No.12513-7 - 2024/08/14 (水) 23:12:23 - SYBR master

>[Re:1] ゲルさんは書きました :
> アガロースゲルから切り出した約9kbのPCRフラグメントをプロメガのゲル精製キットを使って精製すると、収率が10%程度にしかなりません。ウォッシュバッファーにはエタノールが正しく入っており、ゲルは55℃で完全に融解しています。メーカーのトラブルシューティング例に倣って最後の溶出を50℃の水でやりましたが改善しませんでした。何度やっても、誰に見てもらっても改善しません。アドバイスをいただけますと幸いです。

PCR産物で約9 kbだとアプライした量も、見積もり（UV等で測定だけで無く他の方法でも)より多くは無いかもしれないことを考慮してください。電気泳動でマーカーのバンドとの比較で出した濃度の方が、ほぼ正しいです。

で、私の方も最近回収量少なかったの色々変えて、改善したと思えた点を書きます。

1. アガロースをあまり聞いたことの無いメーカーの安価な物、500 gで3万円くらいの物では無く、ちょっとお高い物に変えてください。100 gで2-3万くらいな物です。代表例として、ニッポンジーンの
https://www.nippongene.com/siyaku/product/agarose/agarose_index.html
のシリーズや
関東化学の
https://www.kanto.co.jp/products/baio/dna_rna/bio_electrophoresis/agarose_kanto.html
ですね。海外製品は自分で調べてください。個人的にTakaraの製品はあまり好きでは無いのでお勧めはしません。

2. DNA回収においては、それらの製品の中から成るべくlow-meltの製品を使うと回収量が上がる傾向は有りました。ちなみに現在250-350bp位を主に回収しているのですが(3-4%ゲル)、回収率は70-90%程度出ています。ちなみにPromegaの同じカラム使っていますが、試薬はPromegaが公開しているので、全部自作してカラムだけ毎回購入しています(Promega clubとか言うのに登録すると購入できます)。小さな液量で溶出したい場合、NEBのMonarchの方が使い勝手良いかもしれませんが、buffer等は公開されていないので、ここぞと言うときに使うべきかもしれません。

3.今回は約9 kbなのでゲル濃度は頑張っても0.6-0.8%だと、Low-melt使うと泳動途中でゲル溶けてしまう可能性が高いので、先に新品の1xTAE Bufferとゲルを4度で冷やしておいて、25-50vでゆっくり流してみてください。時間は100 vで行うより倍近くに成りますが、ゲルが溶けるほどまでは温度は上がらないです。昔(30年以上前?かな)Mupidの泳動装置ごと氷冷水で冷やしながら使っていた先輩いました。

4. 経験的にアガロースの硫化物含量(硫酸含有量と記載されている物もある)の、濃度が高いと回収量が減る傾向があります。上記ニッポンジーンの安価なAgarose Sを使用していたときも、ゲル濃度が薄いとき(1-2 %)はあまり気にならなかったですが、低分子を回収しようと3-4%ゲルを使ったときは収率が結構劇的に下がりました。個人的にはHＰにおけるニッポンジーンのAgarose Sの硫酸含有量は、記載ミスでは無いかと思っています。Agaroseの純度についてはメーカ側も結構考慮(実験もしているみたい)しているので、最適なアガロースを聞いてみた方が良いかもしれません。

5. カラムからの溶出に関しては、pHが安定している物を使用した方が経験的には回収率高いので、最近は1xTE(or 溶出bufferで、10 mM Tris-Cl pH7.5-8.0)で溶出しており、dDWは使用していません。

(無題)

削除/引用

No.12513-6 - 2024/08/14 (水) 22:56:51 - EMS

260のところのピークはなくなります。メーカープロトコールでは収率95%と書いてあります。何かご必ずおかしいです。

(無題)

削除/引用

No.12513-5 - 2024/08/14 (水) 22:51:37 - おお

PCRフラグメントの量の見積(精製前)はどうしてる？260では計れんよ。

(無題)

削除/引用

No.12513-4 - 2024/08/14 (水) 22:49:21 - おお

ベクターとかに入れるんだったら、それぐらいでも十分だったりもする。最初のアガロースを溶かすバッファーを多めに入れるといい場合があるような気がする。