>[Re:6] embさんは書きました :
> カラムでの抽出を好まれない理由等ありましたら、お聞きしたいです。
基本的に、RNAであれDNAであれ収量を気にする場合の選択肢としては、
エタ沈>シリカ系カラム>>マグネットビーズ(MB)
に為り、20年以上前ですが出入りしていた日本のメーカと出したデータで有りますが、そのデータを外部に出したことは無いです。
そのときの結論としては、(1)エタ沈系はそこにある核酸全部を沈殿として回収出来るので、見た目泳動の結果以上に取れるけどかなり小さいサイズの核酸も落としてきている(そのため初期のsmall RNAの回収はこちらが推奨されていた)。しかし、コンタミしているssDNAももれなく回収している。(2)シリカカラム系はシリカに吸着できるサイズが溶解液(ほぼグアニジン系)濃度でサイズセレクションが起き、エタ沈に比べ収量が落ちているように見える(5S rRNAやtRNAはほぼ回収出来ないプロトコルが多かったが、最近small RNAも回収出来るキットが出て居るみたい)。(3)MBは自動化の設計が容易いなので全自動システム等に使用されることが多いけど、シリカカラムよりMBとRNAが出会う確率が低下するので、長いRNA(mRNAやrRNA)は回収しやすいけど収量は落ちる。
データを持ち出してきていないので、正しい数値は既に持っていないですが、
エタ沈で10 ug取れたとして、カラムだと5 ugで、MBだと測定不能(当時は測定はUVだった)です。MBは当時発売された自動化システムの性能評価で出したデータで、濃度計れない物使えるか?で当時の研究室での導入を止めた経緯があります。ただ、MBで取ったRNAでもRT-PCRは走ったので、RNAは取れていたみたいです。
>[Re:5] embさんは書きました :
> 桑実胚ではde novoの転写産物が多く存在していると考えています。
> 母性mRNAと胚性mRNAで何か違いが生じるのでしょうか？
de novo転写産物が無ければ母性mRNAはその半減期で減少するので、de novoが起きていなければmRNAは、通常の細胞よりかなり少ないと考えて良いのでは？
だた、de novo転写が起きていても、その種類や数を考えた場合、桑実胚だとmRNAの種類はかなり限定されると思うので、全体のRNA量は減りませんかね？
>[Re:1] embさんは書きました :
> マウス初期胚(morula x50個)のRNA抽出をRNeasy microを用いて行っておりますが、収量が5μg以下と想定よりも低く、困っております。
> 経験のある方はプロトコル、注意点などご教授いただけると幸いです。
16細胞杯でかける50で800細胞由来なので、そんなものでは無いの？もっと多いと思ったの？個人的には5 ugでも、かなり多すぎだと思う。1細胞当たりのRNA量の見積もり正しく出来てる？真核でも1細胞当たり、普通10-20 pgが初期想定量だけれども。ESとかiPS細胞での抽出量から1細胞当たりのRNA量を推定してみたら良いのでは無いでしょうか。
> RIN:8以上
7以上で普通に使えると判断されているので、十分じゃ無いかしら。 |
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