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(無題) 削除/引用 No.12506-12 - 2024/08/11 (日) 09:20:10 - あの 質問に出ている方法の他に、蛍光免疫染色像の比較は必要でしょうね。 定量精度は高くないけど。

(無題) 削除/引用 No.12506-11 - 2024/08/10 (土) 17:02:55 - おお >[Re:10] んさんは書きました : > 10万G・・・？ > 遠心機のローターが最小15mLまでで > サンプルは1.5MLマイクロチューブに入っていて液量は200uL > これを遠心したいってことなら > ローターに接触する15mLチューブ自体は遠心力に耐えられるんだから > 15mLチューブにキムワイプ入れてマイクロチューブの向きに注意して落とせば > 一応破損せずに遠心はできるんじゃない？ > テストは要るだろうけど いや、それはむりだとおもいます。 超遠心機で10万gです。桁間違えている訳ではないです。実際にその遠心力で膜タンパク回収したこともあります。セシウムクロライドでプラスミド精製するときは50万g位出すし。

(無題) 削除/引用 No.12506-10 - 2024/08/10 (土) 16:06:32 - ん 10万G・・・？ 遠心機のローターが最小15mLまでで サンプルは1.5MLマイクロチューブに入っていて液量は200uL これを遠心したいってことなら ローターに接触する15mLチューブ自体は遠心力に耐えられるんだから 15mLチューブにキムワイプ入れてマイクロチューブの向きに注意して落とせば 一応破損せずに遠心はできるんじゃない？ テストは要るだろうけど

細胞膜タンパク質分離抽出kitあります 削除/引用 No.12506-9 - 2024/08/10 (土) 11:15:51 - T T 超遠心不要で、通常の高速遠心機を用いる細胞膜タンパク質の分離抽出kitはいくつか販売されていますので検討ください。細胞全タンパク質における細胞膜蛋白質の存在量は相対的にとても少ないため、ある程度まとまった量の細胞が必要になることが多く、細胞量があまり少ないと収率も純度も良くないです。

(無題) 削除/引用 No.12506-8 - 2024/08/10 (土) 08:29:26 - あの 当方も、そのGpcr extraction kitが、どのメーカーのどの商品か、ピンときません。 明示してください。 なおGPCRなら、細胞膜にでたり、引っこんだりは、するので、仮説どおりにいくとは限らない可能性もありえます。

(無題) 削除/引用 No.12506-7 - 2024/08/10 (土) 06:45:43 - おお >[Re:6] rrrrさんは書きました : > Triton X-114の情報ありがとうございます。 > > 少し調べてみたのですが、 > 1) 通常の抽出溶液にTriton X-114を加えてタンパク抽出をする > 2) ヒートブロックか何かで30℃超まで温める。 > 3) その後分離した層の片方が膜タンパクである (もう片方はサイトゾルリッチ？） > という感じでしょうか？ > そんな感じです。バリエーションがいくらかあるとはおもいますが。ただし使う溶液中にTriton X-100とか入っているとどうなるかわかりません。GPCR extraction kitはバッファーに何が入っているか調べないとわからない。 要するに発現が上がっているかどうかを確認したいのですよね。RIPA Buffer、SDSPAGE Sample bufferやUreaを含む強い可溶化作用をもつものをつかってLysateを作りTotal Lysateで確認してはどうでしょうか。Triton X-1００で可溶化できないならTriton X-114でも可溶化は難しいような気がするので、結局見れないかもしれません。 膜タンパクはたまにSample buffer中でボイルするとアグってしまうことがあるので、Ureaとか使うのがいいかと思います。ただしUreaを使ったときは熱を加えないようにしてください。 すこし不思議なのは、Triton X-100で可溶化して蛋白が検出されないというところです。raftのような溶けにくいところに発現しているのかもしれません。まさかと思うけど、膜に存在しないとか、、、ちょっと変則的かもしれませんが、Triton X-100で可溶化したさいに不溶画分を見てみるといいのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12506-6 - 2024/08/10 (土) 05:38:58 - rrrr Triton X-114の情報ありがとうございます。 少し調べてみたのですが、 1) 通常の抽出溶液にTriton X-114を加えてタンパク抽出をする 2) ヒートブロックか何かで30℃超まで温める。 3) その後分離した層の片方が膜タンパクである (もう片方はサイトゾルリッチ？） という感じでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12506-5 - 2024/08/10 (土) 05:36:43 - rrrr デタージェントは使用しており、以下の２つの溶液を持っています。 1) Triton X-100を含むメディアで抽出したタンパク溶液と 2) GPCR extraction kitから抽出したタンパク溶液 1)ではCD36発現がDetectできなくて、 2)は検出できたものの、仮説とは真逆の結果で介入Aで減少となってしまいました。 2)の溶液 は膜タンパクが含れているとは言え、相対的には少な目ですので、介入AによりCD36がtranslocationしている場合は見かけ上の発現レベルが減少するのかなと思っています。 そこで今回、膜タンパク特異的なCD３６発現を見たいと考えました。

(無題) 削除/引用 No.12506-4 - 2024/08/10 (土) 04:31:17 - おお tritox-114で４度で膜を可溶化して、温度を上げるとTriton X-114と膜タンパクが凝縮して曇ってくるのでそれを遠心（普通のマイクロチューブ用の遠心きで）して回収する方法があるのだけどそういうのはだめなのかな？ ＞現在全組織（脂肪組織）から抽出したタンパク溶液（細胞膜含む） たぶんデタージェント使ってないと思うのですがそういう理解でよろしいですが？

(無題) 削除/引用 No.12506-3 - 2024/08/10 (土) 04:26:27 - あの 超遠心機を使わずに、次のようなもので目的達成できませんか？ 　　https://www.funakoshi.co.jp/contents/63111 どうしても超遠心機を使うということなら、 最初に、そのマイクロチューブが、超遠心機に耐えうるグレードのものか確認をするべきです。 それから、超遠心機の使用方法に詳しい人、特に管理責任者に、使用方法を習うことが大事です。 その上でどうしても、そのタンパクサンプルしかないなら、もっとも小さい超遠心用チューブに合わせて、そのサンプルを希釈するぐらいしか方法を思いつかないです。

(無題) 削除/引用 No.12506-2 - 2024/08/10 (土) 03:59:48 - rrrr 超遠心機にフィットするサイズが最低でも15mlのため躊躇っております。

細胞膜のたんぱく質の抽出 削除/引用 No.12506-1 - 2024/08/10 (土) 03:57:13 - rrrr 細胞膜のたんぱく質を抽出したいと思っています。 10万Gで遠心分離をして、そのペレットを通常時に使用しているバッファーで溶かして使えば良いことは理解しています。 超遠心機も大学内にいくつか保有しています。 問題は、現在全組織（脂肪組織）から抽出したタンパク溶液（細胞膜含む）200ulを通常のマイクロチューブで保管しております。できればこのまま遠心を行いたいのですが、 超遠心機にフィットするサイズが最低でも1.5mlのため躊躇っております。 マイクロチューブ用のアダプターも販売されているようですが、購入は難しいです。 みなさまどのように、超遠心機を使用されていますか？ ご教授ください。

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