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(無題) 削除/引用 No.12503-15 - 2024/08/15 (木) 12:21:31 - G25 昔から酵素なんかを長期保存、非冷凍保存するときに硫安沈殿がもちいられていたはずなんてこと思い出して、、、 例えば昔々、リコンビじゃなくてヒツジ腸からの精製品を使っていた頃のCIAPなんか。プロテアーゼのキャリーオーバーなんかで分解されるためもあって、硫安沈殿で流通、保存されていたなあなんて、 で、参考資料を探していたらこんなのありました。 https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0022175987900263?via%3Dihub PO標識IgGの保存ですが、硫安沈殿による保存が、酵素活性や抗体の品質の保持に優れているとのこと（アブストしか読めてないですが）。硫安がELISAに干渉することもないとも。 当面使うあてがないのなら、硫安沈殿したら使う時が来るまでそのまま冷蔵保存しておけばいいんじゃないかな。 >ペレットの量にもよるかもですけど、、、 ものの本（Antibodies: A laboratory manual, CSH press)によると、 Mab培養上清はスタート体積の0.1 vol （血清や腹水は0.3~0.5 vol)に再懸濁しろとあるので、沈殿はかなりコンパクトになると思います。 また、抗体は50%硫安で沈殿させますが、徐々に濃度を上げていって25%くらいで沈殿したタンパク質をいったん遠心除去すれば、夾雑タンパク質を減らせます。

(無題) 削除/引用 No.12503-14 - 2024/08/13 (火) 06:46:12 - おお >[Re:13] T5さんは書きました : > > 沈殿させて使うにあたっては透析しないといけないな > > WB, 抗体染色などの使用目的でしたら、硫安沈殿したものを少量のPBSで再溶解したら、これをワークストックとしてそのまま冷蔵（冷凍）保存してもいいのではないでしょうか？、使用時は抗体希釈バッファーで100倍以上希釈することになるでしょうから、硫酸アンモニウムの混入による影響はないと思います。 なるほど、高濃度のまま保存するとどうなんだろうとちょっと思いましたが、５０％硫安は２Mちょいでペレットを溶かすとして２００mM程度にはなってますねきっと、ペレットの量にもよるかもですけど、、、

(無題) 削除/引用 No.12503-13 - 2024/08/10 (土) 12:39:51 - T5 > 沈殿させて使うにあたっては透析しないといけないな WB, 抗体染色などの使用目的でしたら、硫安沈殿したものを少量のPBSで再溶解したら、これをワークストックとしてそのまま冷蔵（冷凍）保存してもいいのではないでしょうか？、使用時は抗体希釈バッファーで100倍以上希釈することになるでしょうから、硫酸アンモニウムの混入による影響はないと思います。

(無題) 削除/引用 No.12503-12 - 2024/08/10 (土) 07:48:46 - あの 最近は一般的ではないと思いますが、ウサギとかに免疫して得た血清を凍結乾燥していたぐらいだから、培養液を凍結乾燥しても問題ないと思います。 やったことないけど、硫安沈殿して、そのまま凍結保存もできるかも。

(無題) 削除/引用 No.12503-11 - 2024/08/10 (土) 06:48:08 - おお ありがとうございます。凍結乾燥もいいかもしれませんが気軽に使える環境でなくって、、、培地からいきなり凍結乾燥でもトラブルはないんでしょうかね。

(無題) 削除/引用 No.12503-10 - 2024/08/10 (土) 03:35:46 - あの 使わない、急がない、楽したいなら、ちょっとずつだけ凍結乾燥は？

(無題) 削除/引用 No.12503-9 - 2024/08/10 (土) 00:26:00 - おお あ、そうそう硫安でちょっと思ってたのは沈殿させて使うにあたっては透析しないといけないなというところがちょっと引っかかってました。まあカラムを使っても最終的には溶出した抗体溶液のバッファーを調整しないといけないことがたいていでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.12503-8 - 2024/08/10 (土) 00:22:39 - おお ありがとうございました。確かに濃縮が主な目的でした。誤解を与えていたならすいません。培地成分は何かと腐りやすいので粗精製も兼ねていければと思っています（実際にいくつかのチューブはそこに白いものが蓄積している）。 やはり硫安が簡単で良さそうですね。５０％飽和ぐらいで沈殿するようですね。

(無題) 削除/引用 No.12503-7 - 2024/08/09 (金) 16:55:13 - G25 そういう目的なら、コスト、手間、スループットどれをとっても他のどんな方法より硫安沈殿がうってつけだと思います。 タイトルがPuridication of .....になっていますけど、主目的は精製じゃなくて濃縮ですよね。硫安沈殿は共沈するタンパク質も多いので粗精製にしかならないけど、培養上清なら共沈するタンパク質はほとんどないんじゃないかな。 あっても、濃縮が目的なら構わないだろうし。

(無題) 削除/引用 No.12503-6 - 2024/08/09 (金) 11:21:41 - おお 培地は昔の人が残していったもので、実際培養しているのを見たこともなく血清がどうなってるかもよくわからん状態です（まてよ、培地のボトルが残ってたかも、、、）。ただ培地をBlocking bufferと１対１ぐらいで混ぜてWBすると精製した抗体と同じぐらいクリーンでした（すべての種類でそうかはわかりませんけど）。その抗体ににかんしてはIPしたときもワークしてました。まあたまたまうまく行ったのかもしれません。牛IgGの混入については頭の片隅に残しておきます、アドバイスありがとうございました。値段はさておきT-Gelはなんか良さそうですね。

(無題) 削除/引用 No.12503-5 - 2024/08/09 (金) 09:07:29 - T5 すいません。濃縮程度でいいんですね。昔はPierceのT-Gelというのが安くて簡便な抗体精製レジンがあったのですが、なんか今はすごく高価になってますので、お勧めできなくなりました。そうなると硫安沈殿が次点ですかね・・・

(無題) 削除/引用 No.12503-4 - 2024/08/09 (金) 08:58:50 - T5 もし通常の10% FBS mediumを使った培養上清であれば、FBS-derived IgGが一緒に精製されてくることには注意が必要です。10% FBSでbovine IgG 10〜30 ug/ml くらいです。hybridoma由来のIgG濃度はクローン・培養条件により異なるでしょうが、bovine IgGより少ない可能性もあります。low IgG FBSを使っているとか、serum-free mediumであるとか情報がないと精製工程は濃縮くらいの意味合いしか出ないかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.12503-3 - 2024/08/09 (金) 05:45:08 - おお コメントありがとうございました。カラムもたしかに手っ取り早い気がしますが複数あるので再生するとき違う抗体は（気分だけですが）ちょっと嫌かなとおもったり。あとはあっちこっちに分散していて全量をはあくしてない、、、という状況。また、蛋白性のカラムなので再生方法も限られていて劣化もあるだろうし。そういう意味ではヘパリンとかDEAEを使いたくなる。。。分散しているので見つけ次第硫安とかぶっこむとかしたほうがとか思ったりもします。いろいろコメント待ちながら考えてみます。

(無題) 削除/引用 No.12503-2 - 2024/08/09 (金) 02:25:36 - ん ラボにあるものを使えるのか別途キット買うコストが要るのか どれだけの容量でサンプルごとに分けるのかまとめていいのか 精製抗体の利用法動物種グレード欲しい濃度によって変わるだろうけど 全タンパクで培地除去したところで使い道がないなら もったいなくても断捨離が一番手っ取り早くてスペースを空けれる というのを除けば PAGEでメインの抗体が分かる程度に綺麗にするならProA/Gが無難で 一応ラージなら10mg以上で取れるはず buffer消費するくらいでフィルターはリサイクルできるし カラム買ってまでするなら本体があるの前提でHPLC キットがないならいっそ受託に任せた方が https://www.cosmobio.co.jp/product/detail/antibody-purification-cpa.asp?entry_id=36502#01 そのためだけにキット用意するよりマシかも 紙の本だって自炊するより炊く業者に電子化してもらう方がいい

Purification of IgG from hybridoma sup 削除/引用 No.12503-1 - 2024/08/09 (金) 01:20:20 - おお 昔いた人があつめたハイブリドーマの培養上清が結構冷凍庫に眠っております。スペースを食っているので捨てるかどうかというところですが使えるものもまあまああります。なのでちょっとIgGだけ濃縮できたらなと思っています。王道としてはProtein Gとかで精製するみたいなやり方かと思いますが、なんかもっと簡単なやり方ないかなぁと思ったりもしています。ぱっと手前味噌で思いつくのは硫安で沈殿させるとか、限外ろ過膜で濃縮するとかでしょうか。 皆さんの意見も伺いたいとおもって投稿しました。

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