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(無題) 削除/引用 No.12501-16 - 2024/08/11 (日) 20:02:39 - 弘法 結局謎は解けないまま…

(無題) 削除/引用 No.12501-15 - 2024/08/11 (日) 01:56:29 - おお 色は特に気にすることはないですけどね。

(無題) 削除/引用 No.12501-14 - 2024/08/11 (日) 00:02:27 - churoooo ご回答ありがとうございます。 培地のアデニン含有量を少し増やして実験を再度行ってみようと思います。 質問にお答えいただきありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12501-13 - 2024/08/09 (金) 12:57:17 - 弘法 赤色の色素は液胞に蓄積しますので、溶菌しないかぎりは菌体外には出てきません。そのため培養上清にはあまり色が付きません

(無題) 削除/引用 No.12501-12 - 2024/08/09 (金) 11:39:47 - 弘法 先にも質問しましたが、「あまりコロニーが出ないうちに(3日後)は、ピンク色になってしまいます。2日ほどで生育した白いコロニー」のくだり、「あまりコロニーが出ないうちに」というのがよくわからないものの、2日目に白いコロニーが出て、もう1日経つとそれがピンクになったということでしょうか？それであれば、1つ前の私の書き込みで説明したとおりです。

(無題) 削除/引用 No.12501-11 - 2024/08/09 (金) 11:36:27 - 弘法 AH109株の4つのレポーター遺伝子の1つであるADE2遺伝子はアデニンの生合成に必要な遺伝子で、BaitとPreyが結合する場合には形質転換体はADE2レポーターを発現し、アデニンを含まない培地で生育できます。BaitとPreyが結合しない場合には、アデニンを含まない培地では生育できませんが、アデニンを含む培地でも生育に伴って次第にアデニンが不足するようになるため、アデニン生合成系が動き出し、Ade2タンパク質が触媒するステップの前の代謝中間体が溜まってだんだんにピンク色を呈するようになります。大きな問題はないのですが、それを避けたいのであれば培地のアデニン濃度を増やすことが有効です。

(無題) 削除/引用 No.12501-10 - 2024/08/09 (金) 10:12:09 - churoooo 皆さんご返答ありがとうございます。 　日にちについては、例えば8月1日の18時にSD-2培地にスプレッドしたとすると、二日後というのは、8月3日の18時という認識です。 ピンク色になるという点では、コロニーの色がピンク色になり周りは、特に菌液部位においては色はついていませんでした。 　SD-2培地(-Leu,-Trp)なのでBait(pGBKT7 Vector), Prey(pGADT7 Vector)の両プラスミドをいれている場合、白いコロニーが生育するのではないのですか？

(無題) 削除/引用 No.12501-9 - 2024/08/09 (金) 09:43:18 - 弘法 すみません、ちょっと誤解していました。この段階では-Leu-Trpプレートでプラスミドの選択を掛けているだけで、レポーター遺伝子の発現はテストしていないみたいですね。 その状態でピンクになるのはおそらくtwo-hybrid法としてnegativeで、ADE2レポーターが発現していないことを表していると思われます。 前に書いた繰り返しになりますが、プレートで元気に生えていたのに同じ組成（マイナス寒天）の液培で増えないというのは何かがおかしいので、液体培地を作り直すことをお勧めします。 タイムコースがよくわからないのですが、「2日ほど」というのはどこから数えた日数ですか。3日後にピンクのコロニーが出て、更に2日経つと（ピンクより小さめの）白いコロニーが出るということでしょうか。その場合は既に皆さんがお書きになっているように、白いコロニーはミトコンドリア機能が損なわれたpetiteと呼ばれる表現型を示す変異体ですので、以後の解析には使わない方が良いです。

(無題) 削除/引用 No.12501-8 - 2024/08/08 (木) 23:10:38 - egeria すみません、遺伝子型を勘違いして完全に間違ったことを言っていました。ADE2がレポーターになっているなら白くなるのが正常ですね。

(無題) 削除/引用 No.12501-7 - 2024/08/08 (木) 18:58:10 - 弘法 ドロップ試験というのは、形質転換に用いたTRP1とLEU2の2つのプラスミドの一方を脱落させるということでしょうか？ それはともかく、プレートで元気に生えていたのに同じ組成（マイナス寒天）の液培で増えないというのは何かがおかしいので、液体培地を作り直すことをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.12501-6 - 2024/08/08 (木) 18:42:22 - 弘法 AH109株はADE2もレポーター遺伝子として使っていますので、十分に強いtwo-hybid positiveであればコロニーは白くなるはずです。 記載内容がはっきりしないところがあるのですが、ピンク色になってしまうのは育ってきたコロニーの色ですか？それともまき出した菌体が全体に広がっている部分ですか。後者であれば形質転換されていない酵母が持ち込みの栄養でうっすら生えてそこで止まってるバックグラウンドなので気にする必要はありません。

(無題) 削除/引用 No.12501-5 - 2024/08/08 (木) 14:57:09 - おお Y187 and CG-1945 carry the ade2-101 mutation. On medium with low amounts of adenine, the colonies will turn pink after a few days and may turn darker as the colony ages. These colonies grow to >2 mm in diameter. However, small (<1 mm) white colonies will form at a rate of 1&#8211;2% due to spontaneous mutations that eliminate mitochondrial function (Holm, 1993). Avoid these white colonies when inoculating cultures. In the absence of GAL4, AH109 also exhibits the ade2-101 phenotype. However,in the presence of protein interactions, the ADE2 marker complements in cis the AH109 ade2-101 phenotype https://www.med.upenn.edu/robertsonlab/assets/user-content/documents/matchmaker-two-hybrid-system.pdf

(無題) 削除/引用 No.12501-4 - 2024/08/08 (木) 14:46:11 - egeria 間違えました、赤くなるのはade1またはade2の変異体です。ade3変異は逆に色素の生成を止める方でした。

(無題) 削除/引用 No.12501-3 - 2024/08/08 (木) 14:39:46 - egeria 赤色を呈するのは正常な表現型なので、無視してかまいません。むしろ、低頻度で現れる全く赤くならないコロニーは何らかの異常が起きているので、それは実験に使うべきではありません。 コロニーが赤くなるのはade2またはade3が機能していない酵母に見られる表現型です。詳しいメカニズムは不明ですが、蓄積したアデニン合成中間体が酸化されて色素に変換されると言われています。 途中から色が変わるのは、アデニンが豊富な環境では合成系が抑制されるために中間体の蓄積も起きないからです。コロニーが大きくなるとその周辺のアデニン濃度が低下し、合成系が活性化されて色素の生成が進み、呈色します。液体培養の場合は培地のアデニン濃度によって変わりますが、定常期に入ると赤くなることが多いです。

(無題) 削除/引用 No.12501-2 - 2024/08/08 (木) 12:56:11 - おお ピンクになるのは問題にならないと思ってますが、、、

Yeast two-hybrid法 削除/引用 No.12501-1 - 2024/08/08 (木) 11:39:57 - churoooo いつも拝見させていただいております。 20代　大学生です。 Yeast two-hybrid法を用いた相互作用解析を最近行っております。 しかし、酵母(AH109株)のコンピテントセルを作製し、プラスミドDNAを導入し、SD-2培地で生育させているのですが、あまりコロニーが出ないうちに(3日後)は、ピンク色になってしまいます。2日ほどで生育した白いコロニーを別のSD-2培地に継代し、菌体量を増やそうとするも十分な量が得られずにピンク色になってしまいドロップ試験で合わせたい濃度にまで達しません。 導入方法としては、50%PEG4000, LiAc, TEを用いた形質転換を行っています。 何か手がかりがありましたら教えて頂きたいです。 よろしくお願いします。

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