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(無題) 削除/引用 No.12500-13 - 2024/08/09 (金) 11:25:12 - おお >[Re:12] あのさんは書きました : > WBに使う抗体にも注意しないといけないでしょうね。本当に、同等に結合するのかとか。 おーそうかもしれん。ナイスです。

(無題) 削除/引用 No.12500-12 - 2024/08/09 (金) 04:33:43 - あの WBに使う抗体にも注意しないといけないでしょうね。本当に、同等に結合するのかとか。

(無題) 削除/引用 No.12500-11 - 2024/08/09 (金) 00:11:45 - おお >[Re:9] asanさんは書きました : > > ちなみに逆に活性化する場合はconstitutive activeなどです。 > > 訂正ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12500-10 - 2024/08/09 (金) 00:03:53 - おお 簡単にまとめますと、DNの発現量とDNの効果についてはメカニズム的には何某かの関係があるかもしれないし、DNがWTより同じ過剰発現でDNのほうが不安定なのかもしれません。あるいはDNのmRNAの安定性とか翻訳効率の問題なのかもしれません。この辺は追求しなければ結論でないでしょう。 DNで実際にWTの活性が抑制されているのなら、テクニカルにはDNの発現量は関係ありません。実際にそのDNが使われている論文があるのならその文献を参照してDNとして働いていることを再確認したり、あなたの系で同様かどうか見てみてもいいかもしれません。まあ現象としてからベクターとかと比較してDNでWtと反対の効果が出ているのならそれでも論文的にはアクセプトされる可能性が高いです。あなたのアイデアでDNを作ったのならDNとして働いている何らかの根拠がほしいところです。

(無題) 削除/引用 No.12500-9 - 2024/08/08 (木) 22:53:04 - asan ドミナントネガティブというのは、それがいるとWTのタンパク質に比べて優位に働いて正常機能を抑えるので、発現抑制（ノックダウン）と同じような効果をもたらす変異体の作用（作用様式）のことです。酵素が複合体で機能する時とか、キナーゼの自己リン酸化活性などのバランスが歪むことで起きる場合が一般的です。 タンパク質そのものの発現量の問題とはDNそのものの意味は基本的には無関係です。結果的にそのような変化をする場合が重要な意味を持つかどうかはわかりません。 ちなみに逆に活性化する場合はconstitutive activeなどです。

(無題) 削除/引用 No.12500-8 - 2024/08/08 (木) 11:14:14 - おお もしかしてその蛋白が何らかの現象を抑制する活性を持っていて、その抑制に直接寄与するドメインを削ったということでしょうか？ であればそのDNは抑制のために何らかの蛋白に結合するがその抑制効果が発揮できないという話かもしれないと思うのですがどうでしょう。もし結合してWTと競合するだけなら直接的に安定性は関係ありませんがEndoの発現よりかなり強くないとDNの効果は期待できません（場合によってはDNがターゲットにWTより強い親和性を持つようなこともありえますが、そこはわかってないとなんとも言えません）。構造的に不安定であるならば、２通りのシナリオがありそうです。 うまく構造が取れないのでWTと競合で不利になるーこの場合うまくDNとして働かないか、Endoの発現に対して相当強い発現量が必要。 うまく構造が取れないので結合した蛋白に影響を与えるー構造的に不安定であるのでターゲットの蛋白と結合した複合体が完全な形を取れない。場合によっては複合体が分解されてしまう。 そもそも複数の解釈が成り立つなら一般的、特別とかいうカテゴリーに分けようがないのではないでしょうか。そのDNについて詳細な情報があればもうちょっと具体的な話になると思います。

(無題) 削除/引用 No.12500-7 - 2024/08/08 (木) 10:20:04 - eeec >autoinhibitionを行うたんぱく質のinhibitoryドメインを削除したタンパク質です。 ごめんなさい。これは誤解を招く表現でした。

(無題) 削除/引用 No.12500-6 - 2024/08/08 (木) 06:56:14 - おお すいませんがよくわからなくなってきました。autoinhibitionを行うたんぱく質のinhibitoryドメインを削ったらドミナントアクティブと思えますが。。。何かもっと考えていることと違うことが起こっているのでしょうか。 リン酸化による活性化とかならその部分のアミノ酸を置換するとかありますが、それならそんなに構造が変わるのだろうかというのはありますが、、、そうではないのですね。。。

(無題) 削除/引用 No.12500-5 - 2024/08/08 (木) 06:46:52 - eeec autoinhibitionを行うたんぱく質のinhibitoryドメインを削除したタンパク質です。

(無題) 削除/引用 No.12500-4 - 2024/08/08 (木) 06:34:06 - おお >いろいろ例外はあると思うのですが、基本的には構造が不安定になっていることと、DNは意味が違いますよね？ 構造が変わったから活性がないということがあればそうとも言い切れないのではないですか？それよりどういう変異を入れたDNですか？

(無題) 削除/引用 No.12500-3 - 2024/08/08 (木) 06:26:38 - eeec いろいろ例外はあると思うのですが、基本的には構造が不安定になっていることと、DNは意味が違いますよね？ westernで比較をしたときに、WTの強制発現と比較して、DNの強制発現でレベルが低いというのは、全くの別事象ですよね。もちろん、構造が不安定になっているけれども、DNの作用を示すという現象自体は存在するとは思いますが。

(無題) 削除/引用 No.12500-2 - 2024/08/08 (木) 06:22:34 - おお DNの定義は色々あると思いますが、DN自身に活性がなくWTのダミーになることで（WTのターゲットのタンパク質に結合するとか）WTの細胞への影響を抑制するとイメージすればいいでしょう。 DNが分解するのはそれと独立した現象なのかはDNの作用の仕方次第でしょう。単なるダミーならEndoの蛋白より過剰に発現することが望ましい。DNがターゲットの蛋白に結合してターゲットとともに分解されるようであれば過剰発現したWTより発現が低いのはわかります。心配なのはDN用に変異を入れたことにより構造的に不安定になったりして分解されているということですが、細かいことは置いといてDNとして作用していることが確認できていれば実験としてはなんとかなっていると思います。

ドミナントネガティブの解釈 削除/引用 No.12500-1 - 2024/08/08 (木) 05:08:13 - eeec 論文をいくつも読んで確認したつもりですが、念のため投稿させていただきます。 ドミナントネガティブの解析をしております。 WTとDNのたんぱく質を過剰発現させた後に、western blottingを行ったとき、DNのたんぱく質の発現量とWTの発現量は概ね同じだけれども、機能は阻害されるということでいいでしょうか。 DN（と想定される）のたんぱく質が減少しているなら、これは分解が起きやすいとうことで、基本的には、DNの現象自体とは直接的には関係ないということでいいでしょうか。

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