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(無題) 削除/引用 No.12498-9 - 2024/08/09 (金) 14:55:04 - KK その後Addgeneに直接きいて3種類ほど教えていただいたのですが、あまりよいプラスミドはありませんでした。 ベクタービルダーでの設計を検討してみようと思います。 皆様ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12498-8 - 2024/08/08 (木) 21:22:59 - KK おお様 ありがとうございます。 ベクタービルダーで自作のプラスミドが設計できることははじめて知りました。これを機に自分でもいろいろと触ってみようと思います。 クリスパー様 ありがとうございます。pLBを教えていただきありがとうございます。 ただ私はヒト培養細胞での実験をしておりまして、pLBはmouse U6 promoterと記載されておりました。ヒトとは互換性ないという理解でよろしかったでしょうか？ mp様 ありがとうございます。やはりmiRNAベースのプラスミドも魅力的ですね。これを機に勉強させていただきます。 皆様ご教授いただきありがとうございます。 できれば今のshRNAの配列のKDでフェノタイプがでておりますのでこれを活かしたく、上司からもAddgeneで実績あるものがあればとあります。いろいろ探してはいるのですが、ヒトU6 promoterでのshRNA + GFP/mCherryなどでよいプラスミドをご存知であればご教授賜れますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.12498-7 - 2024/08/08 (木) 10:14:45 - mp asanさんの紹介しているSGEP使ったことありますがいいですよ。GFPの発現量とmiRNAの発現量が相関するので、GFP hiのpopulationをsortすればKDの効率も良くなりますし。SGEPにcompatibleなヒト、マウス全ての遺伝子のtarget配列も公開されています。結構な数の遺伝子を試しましたが、ハズレはなかったです。ただ今のshRNAは諦めて、一から効率確認ということにはなりますけどね。

(無題) 削除/引用 No.12498-6 - 2024/08/08 (木) 07:09:01 - クリスパー pLBってプラスミドいいよ、addgeneです。

(無題) 削除/引用 No.12498-5 - 2024/08/08 (木) 00:54:39 - おお https://en.vectorbuilder.com/vector/VB010000-0009mxc.html レンチだったらこんなのとか？ ここは蛍光タンパクだけで耐性遺伝子なしでもコンストラクト組んでいると思う。

(無題) 削除/引用 No.12498-4 - 2024/08/07 (水) 21:54:05 - KK TS様 ありがとうございます。 まさにこのようなプラスミドを想像しておりました。ただバックボーンのプラスミド（現在使用中のshRNAの配列をサブクローニングするため）の値段をみるとなかなかのお値段ですね。。。 他社やAddgeneでもみてみようと思います。 asan様 ありがとうございます。 1つのプロモーターで行うプラスミドが存在することははじめて知りました。現在使用中のshRNAの配列で十分KDできておりますので、そちらをこのプラスミドにサブクローニングするイメージになりますでしょうか？ また、2種類のプロモーターを使用する場合（EF1αとU6のような）と比べて、効果に違いがあるなどasan様が実感されていることはありますでしょうか？ TS様に教えていただいた流れでAddgeneを調べていた際に、下記のプラスミドをみつけましてなかなかよいかと思っていましたので、もし可能ならご指南いただけますと幸いです。 https://www.addgene.org/31845/

(無題) 削除/引用 No.12498-3 - 2024/08/07 (水) 21:26:00 - asan 通常のshベクターの場合はPol IIとPol III系のRNAと遺伝子のプロモーターが違うので別途乗ってるベクターを使用することになります。ただ、shは発現してても配列がバリデートされてないものの場合は、十分ノックダウン効果が出ないことも多々あるので（設計が大変)、最近はmirRNAベースのノックダウンベクターとかを使う方が効率がいいって思います。この場合pol II系のプロモーターがつかえるので、普通にGFPの後ろにmiRNAベースのKD配列とかが組み込まれてて一緒に発現させるベクターがあります。 雑にやるならMOIが十分あるという前提でいうならばco-infectionでEGFPベクターのタイターを下げて入れて光ってる細胞を回収してこればマルチプルで入ってる可能性は高いというやり方はできるでしょう。まあ、初代培養で効率が悪いってなら色々な部分が問題ありそうですので、KDはmirRNAベースのものを使ったほうが効率いいですよ。 https://www.addgene.org/111170/ ↑こういうやつです。

(無題) 削除/引用 No.12498-2 - 2024/08/07 (水) 17:44:59 - TS 各社から販売されていると思います。 例えばこういうのですかね。 https://www.origene.com/products/rnai/shrna-lentiviral-particles

shRNAがtransductionされた細胞を可視化する方法 削除/引用 No.12498-1 - 2024/08/07 (水) 16:55:35 - KK いつも勉強させていただいております。 in vitroで、初代細胞にlentivirusを用いてshRNAをtransductionする実験をしております。puromycinでのselectionはいくつかの濃度を試しましたが、いずれもうまくいきませんでした（細胞死する濃度だとtransductionされた細胞も弱ってしまう）。そのためtransductionした細胞をselectionせず、そのまま実験に使っています（MOIを調節することで、80%以上の細胞にtransductionされていることはGFP強制発現の系で確認しております）。 この実験系において細胞の遺伝子解析やタンパク発現をみている間はよかったのですが、免疫染色しようと思ったときに個々の細胞でどれがtransdutionされているかがわからないことが予想されました。 shRNAがtransductionされている細胞を可視化する方法につき思案しております。例えばshRNAとEGFPの2つのプロモーターを含むプラスミド等はあるのでしょうか？（検索範囲では小生の知識不足もあってかわかりませんでした）。 皆様ご助言いただけますと幸いです。 何卒よろしくお願いいたします。

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