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(無題) 削除/引用 No.12490-12 - 2024/08/04 (日) 12:14:41 - G25 ああ、あとMolecular Cloning 初版から一貫して、プロトコルの羅列じゃなくて、背景となる歴史や原理、理と文献に紙面を割いてきた。新しい版では若干、比重が減ったように思うが、

(無題) 削除/引用 No.12490-11 - 2024/08/04 (日) 11:53:01 - G25 > そう言うので今簡潔にまとまっといいテキストってありますかね。 正直言って私が主に教材にしていたのは、BRL、NEB, Stratagene, Promega、Clontech、Fermentas、Takaraなどなど各社のカタログのappendexや請求すると無料でもらえるガイドブックなどです。制限酵素の基礎知識や理論なんかも主な知識の源はそういうものから。 今は、印刷版のカタログがほぼ絶滅でwebカタログで製品を検索するだけで、周辺知識に触れる機会が激減しているように思います。メーカーもそういうお金にならない情報サービスには熱心ではなくなったようで。テクニカルな記事を集めたBRLのFocusとかPronega note のような無料定期刊行物も絶滅してしまった。 反面、今ではネットで検索すれば教材が見つけられるようになりました。 https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/9401/9401_yomoyama.pdf https://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes#Nomenclature_.26_Abbreviations

(無題) 削除/引用 No.12490-10 - 2024/08/04 (日) 11:21:18 - G25 > T7とかT3とかってプロファージであって本来の大腸菌のポリメラーゼじゃないですもんね・・ プロファージというのはファージの生活環の中で、溶原化(lysogenic cycle)と言ってファージゲノムが宿主ゲノムに組み込まれた状態。ファージとしての増殖をせず宿主の溶菌もおこなわずおとなしくしている。 T7/T3は元々溶原化しないファージ。ファージプロモーターやRNAポリメラーゼ遺伝子をリコンビナントとして利用しているだけ。

(無題) 削除/引用 No.12490-9 - 2024/08/04 (日) 10:02:55 - おお こういう知識は分子生物学のテクニカルなことが中心のテキストよりは、遺伝学のテキストで解説がしっかりされているように思える。そう言うので今簡潔にまとまっといいテキストってありますかね。勉強してもらうにはそういうのをあてがったほうが良さそうなので。。。結構分厚いGene（遺伝学）の教科書的なものは有名なものがありますが、、、

(無題) 削除/引用 No.12490-8 - 2024/08/04 (日) 01:27:11 - れっど G25さま大変勉強になります。 lacIqの存在もいまいち理解できていませんでしたが、よくわかりました。 ＞そりゃあーた、大腸菌のRNA polymeraseですよ。 ・・そういうことですよね。 T7とかT3とかってプロファージであって本来の大腸菌のポリメラーゼじゃないですもんね・・ すみません、今理解できました。 ありがとうございます。疑問点が解消できました！

(無題) 削除/引用 No.12490-7 - 2024/08/03 (土) 18:28:29 - G25 >BL21じゃダメなんだな。ゲノムに組み込まれたlambdaDE3というプロファージにPlac-T7 RNA polが乗せてあるのがBL21(DE3)。 pETやpMALのようにT7 RNA polを噛ませず直接Placで外来遺伝子を発現する系ではDE3なしのBL21を使いますけど。

(無題) 削除/引用 No.12490-6 - 2024/08/03 (土) 17:26:36 - G25 >宿主のポリメラーゼが誘導発現するのはB21などの発現ベクター大腸菌のみ、 BL21じゃダメなんだな。ゲノムに組み込まれたlambdaDE3というプロファージにPlac-T7 RNA polが乗せてあるのがBL21(DE3)。 �@ブルーホワイトセレクションの場合の、lacリプレッサーは、大腸菌ゲノムにコードされていると考えていいのでしょうか？ 初歩でいいから遺伝子型の読み方を覚えて、遺伝子型を見て性質を把握できるようにするといい。 https://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100003627 IPTGでON/OFFする場合、野生型のlacIではなくlacI^qという高発現アリルを使う。IPTG誘導をかけていないときに蛇口がよりしっかり閉まるから。クローニングによく使われるDH5alphaはlacI^qではないのでいIPTGを入れなくてもlacZが発現する。JM109やXL-1 BlueなんかはlacI^qなので青白選択する時はIPTGが必要。これらのlacI^qはゲノムではなくF’エピソームに乗っている。おそらくゲノム上に野生型のlacIがあってエクストラにlacI^qを持たせていると思う。 また、タンパク質発現ベクター(pET, pGEX, pMALなど)はそれ自体にlacI^qをのせてある。 タンパク質発現によく使われるBL21系統の宿主はlacI^qを持ってないですから。 >�APlacを認識するポリメラーゼっていわゆる何と呼ばれているものでしょうか？ (T7やT3、SP6などのポリメラーゼではないんですよね。それともT3やSP6などのポリメラーゼが多少Placを認識して発現すると考えるのでしょうか？) そりゃあーた、大腸菌のRNA polymeraseですよ。真核生物と違って大腸菌のRNA polは1種類しかない。lacオペロンのプロモーターでラクトース代謝系の制御を受けるというだけで、転写するのは大腸菌の遺伝子を転写するRNA pol。

(無題) 削除/引用 No.12490-5 - 2024/08/03 (土) 14:44:08 - れっど 皆さんご返信ありがとうございます。 宿主のポリメラーゼが誘導発現するのはB21などの発現ベクター大腸菌のみ、またブルーホワイトセレクションは、T7ポリメラーゼが大腸菌にそもそも存在していない、など大変参考・勉強になります。 すみません、追加で二点疑問点があって教えていただけるでしょうか。 �@ブルーホワイトセレクションの場合の、lacリプレッサーは、大腸菌ゲノムにコードされていると考えていいのでしょうか？ �APlacを認識するポリメラーゼっていわゆる何と呼ばれているものでしょうか？ (T7やT3、SP6などのポリメラーゼではないんですよね。それともT3やSP6などのポリメラーゼが多少Placを認識して発現すると考えるのでしょうか？)

(無題) 削除/引用 No.12490-4 - 2024/08/03 (土) 11:54:51 - おお 大腸菌クローニングのブルーホワイトセレクションには普通T7ポリメラーゼがない大腸菌が使われます。T7ポリメラーゼはT7バクテリオファージのゲノムにコードされていて大腸菌のゲノムにはありません。 白青判定ように最初に広まったベクターpUC１９の説明が以下でされています。 https://www.mobitec.com/products/vector-systems/e.-coli-expression-systems/v33202/e.-coli-vector-puc19 Placと書かれている部分がプロモーターで大腸菌のLacオペロンのプロモーターを使っています。これがすでに説明があるようにLacIで抑制されているとプラスミドないのLacZが発現しません。 T7ポリメラーゼを使う系はタンパク質の発現に特化した大腸菌BL21（DE３）などが使われ、この大腸菌はゲノムにT7ポリメラーゼ遺伝子が組み込まれています。

(無題) 削除/引用 No.12490-3 - 2024/08/03 (土) 11:47:40 - G25 青白選択ならPlacプロモーターから発現するのはlacZ。MCSに外来DNAが挿入されているとlacZが中断されて機能しなくなる。 PlacプロモーターからT7 RNA ポリメラーゼを発現するのはpETベクター系で融合タンパク質を発現する時。 IPTGの誘導で宿主(BL21(DE3)など)に導入されているPlac-T7 RNA polからT7 RNA polが発現して、これがベクター上のT7プロモーター下の外来遺伝子を発現する。

(無題) 削除/引用 No.12490-2 - 2024/08/03 (土) 11:07:04 - まず メジャーだから教科書にものってそうだけど https://www.funakoshi.co.jp/contents/51935 リプレッサーを外すから生産が始まるイメージ

IPTGによる発現誘導 削除/引用 No.12490-1 - 2024/08/03 (土) 10:38:45 - れっど 関東在住の20代学生です。 いつもよく拝見させていただいています。 大腸菌クローニングのブルーホワイトセレクションについて質問させていただきます。 LacZ内のMCSに目的遺伝子をインサートし、IPTGを添加して遺伝子の「発現」を誘導させますが、この際の遺伝子の「発現」とは、一般的には大腸菌宿主ゲノムのT7ポリメラーゼを誘導させるという考えでよいでしょうか？ それともLacZ遺伝子を誘導させるのでしょうか・・？ 初心者の質問で申し訳ありません・・ ご指導いただけますとありがたいです。 何卒宜しくお願い致します。

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