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(無題) 削除/引用 No.12482-23 - 2024/08/04 (日) 15:12:28 - あの 参考までに、 当方では、使用直後のカセットは水道ですすいで、洗いができる待ち時間がくるまでは必ず水をはっておくルールにしています。 この塩抜きが大事なようです。

(無題) 削除/引用 No.12482-22 - 2024/08/04 (日) 15:06:07 - あの 実は、先に書いたアトーのゲル(3から14%)をトランスブロっトターボに使ってみた時の目的は高分子でした。 転写後のゲルをCBB染色しながら、バイオラッドのサポートのアドバイスを聞きながら、設定を検討しましたが、おおよそ350kDaぐらいより大きいのはゲルに残りました。　その研究自体をやめたので、それ以上の検討はしませんでしたが、ウェット式が必要だろうと考えています。 大雑把ですが、200とか250kDaとかまでなら、トランスブロっットターボの設定変更で良いだろうなと考えています。

(無題) 削除/引用 No.12482-21 - 2024/08/04 (日) 13:57:58 - 150kDa ところで、あのさんが仰る洗浄の話は大事だと思います。ラボメンバーに洗いが適当な奴がいた時は、1年も持たずにヒビが入りました。その時は、BioRadが無償で交換してくれましたが。結構前の話なので、今だとどうかな？

(無題) 削除/引用 No.12482-20 - 2024/08/04 (日) 13:44:27 - 150kDa >Transfer後のゲルのCBB染色でなにか染まるかどうかですWetでONの場合私の手技、環境ではなんにも染まりません。 私も最初14時間位のトランスファーで同様のことをやって、ゲルが染まらないことを確認しました。で、トランスブロットターボの方のゲルは高分子側が確かに少し染まりました。でも、WBの結果はトランスブロットターボの方が良かった（この時は圧勝と言っても良い位に良かった）。 恐らく長過ぎるトランスファー時間ではやはりメンブレン（Immobilon-Pを使いました）からタンパク抜けていくんだろうな、というのが時間を振った理由です。理屈上は最適な時間を選べば、（ゲルに少し残る）トランスブロットターボよりも強いシグナルが得られる筈ですが、少なくとも自分の選んだ時間（8-16時間を2時間ごと）では、トランスブロットターボの方が結果が良かったです。 タンパクによるとか、更に細かい時間を選ぶとか色々あるのかもしれませんが、結局はトランスファー時間10分（最初からデフォルトで入ってるHigh MW用のプロとコロールです）のトランスブロットターボを使った方が簡単に再現良く良好な結果を得られています。なので、私は従来のWetのやり方に固執する理由が無くなった次第です。

(無題) 削除/引用 No.12482-19 - 2024/08/04 (日) 12:46:23 - おお >[Re:18] 150kDaさんは書きました : > > どうも短時間でできるというものは高分子で若干残っている印象があって、実際トランスブロットターボの使用例とかみると転写後のげるの染色で他と比べたらいい感じだけどやはりバンドがあったりする。ちょっと気持ち悪いんですよね。。。 > > おおさんの言う「高分子」って、どれ位のサイズの話なんでしょう？ ゲルの濃度によるだろうから一概にどれくらいと言い難いですが、ゲルの上から４分の１とか３分の１ぐらいまでの領域ですかね（Gradient gelではマシかも知れないですけど）。昔の基準では目的の蛋白がゲルの上から３分の１よりも進んだところに来るのがベターという話もあったかと思います。 > > 私が研究してる分子は150kDaのバンドで、Wetの長時間（8-16時間で振ってみた）とトランスブロットターボで何度も比較したんですが、何度やっても後者の方が結果が良かった（同じ露光時間でバンドが強かった）です。 なるほど、参考になります。私が普段意識しているのはTransfer後のゲルのCBB染色でなにか染まるかどうかですWetでONの場合私の手技、環境ではなんにも染まりません。ただここの蛋白となると逆になることもあるのでしょうね。ご指摘のようなこともあるようなので実はトランスブロットターボが使おうと思えば使える環境でありますのでちょっと使ってみてもいいかなとも思うようになってきました。 > > 150kDa以上のサイズだとどうかわかりせんが、そもそも150kDa以上だと私が普段使ってるミニゲル(NuPAGEのやつ）では解像度が足りなくなるので、そもそもトランスブロットターボでやろうと思わないですしね。 > どういうTransferをするかどうかもありますが、私は基本ゲルは作っているので１５０以上なら５から６％のゲルを用意しますね。

(無題) 削除/引用 No.12482-18 - 2024/08/04 (日) 11:45:45 - 150kDa >[Re:16] おおさんは書きました : > 横槍をいれるような書き込みになるかもしれませんが、、、 > > どうも短時間でできるというものは高分子で若干残っている印象があって、実際トランスブロットターボの使用例とかみると転写後のげるの染色で他と比べたらいい感じだけどやはりバンドがあったりする。ちょっと気持ち悪いんですよね。。。 おおさんの言う「高分子」って、どれ位のサイズの話なんでしょう？ 私が研究してる分子は150kDaのバンドで、Wetの長時間（8-16時間で振ってみた）とトランスブロットターボで何度も比較したんですが、何度やっても後者の方が結果が良かった（同じ露光時間でバンドが強かった）です。正直半信半疑だったんですが、カタログ通りでした。 150kDa以上のサイズだとどうかわかりせんが、そもそも150kDa以上だと私が普段使ってるミニゲル(NuPAGEのやつ）では解像度が足りなくなるので、そもそもトランスブロットターボでやろうと思わないですしね。 以上、参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.12482-17 - 2024/08/04 (日) 10:54:21 - あの バイオラッドもよくわかっていて、設定を色々変えれます。 購入時にすでに色々　入っているし、ターボブロットにしか使えない訳ではないです。 具体的には、サポートに電話すると色々教えてくれます。 そもそも、高分子すぎて、セミドライでは無理な分子量だと、ウェット式で長時間にせざるを得ないです。

(無題) 削除/引用 No.12482-16 - 2024/08/04 (日) 10:08:32 - おお 横槍をいれるような書き込みになるかもしれませんが、、、 どうも短時間でできるというものは高分子で若干残っている印象があって、実際トランスブロットターボの使用例とかみると転写後のげるの染色で他と比べたらいい感じだけどやはりバンドがあったりする。ちょっと気持ち悪いんですよね。。。

(無題) 削除/引用 No.12482-15 - 2024/08/03 (土) 12:03:32 - バチラス あの様 メンテに関する注意点を教えていただきありがとうございます。カセットの取り扱い・洗浄については教えていただいた点に注意して使用するようにします。あの様のアドバイスを受けて改めてネットで検索したところ、複数の方が同様の点を指摘していることを発見しました。使用後のカセット洗浄はしっかり行うようにします。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12482-14 - 2024/08/03 (土) 05:10:44 - あの 誤字ありました 　一色は誤字で、 　正しくは一式です

(無題) 削除/引用 No.12482-13 - 2024/08/03 (土) 05:07:03 - あの バチラスさん 当方と同じものを使い始めるという結論ですので、当方の失敗を基に注意点を２点。 (1)使用後には、水道水をカセットに満たしておいて、塩類を抜くことが重要です。 これが不十分で、すすぎ洗いだけだと、熱と電気のtsめに、そのうちにカセットにヒビ割れが生じます。 そして転写むらなどの原因になります。 ちなみに、カセット2個を買うぐらいなら、新品一色買った方が良いぐらいの値段になります。 特殊なアロンアルファで、ヒビ割れを治してみたこともありますが、新品一色を購入し直したので、なんとなく使わずに放置しています。 (2)カセットの奥側と、本体挿入部の受け側に、時々、同梱されている長い綿棒のようなもので、メンテナンス用のオイルを塗る必要があります。もちろん電源を抜いてから。 実は、本体内部の受け側には、カセットが挿入されて押されることで、引っ込む端子がついています。メンテナンスが悪いと固着して動かなくなります。 このトラブルが世界的に多かったらしくて、この稼働端子の形状が、現行品では改良されていますが、メンテナンスは必須です。 これにも気づかずに固着させた本体が当方にはありますが、ダメもとで、接点復活スプレーをして、オイルを塗ったら、稼働はするようになりました。これもなんとなく使わずに放置しています。 以上の２点は、取説を隅々まで読めば書いてあるけど、気づかなかったり、し忘れたりしやすい注意点です。

(無題) 削除/引用 No.12482-12 - 2024/08/02 (金) 20:32:53 - バチラス 皆さま 大変ありがとうございました。ランニングコストも考慮してBioRadのトランスブロットターボを発注しました。iBindについて近辺で情報が無かったのですが、本フォーラムを通じて実際の利用者の方々からご意見を聞くことができとても参考になりました。まずはトランスブロットターボを購入しましたが、次に予算に余裕ができた際にはiBindを購入しようと思います。

(無題) 削除/引用 No.12482-11 - 2024/08/02 (金) 14:33:24 - wwn あの様 ないです。 Cnaget Signal自体はあるのですが、iBindを使う様になって研究室の他の人も使用していないようです。

(無題) 削除/引用 No.12482-10 - 2024/08/02 (金) 11:55:45 - あの wwn様 ありがとうございます。 もうひとつ教えてください。iBindで、東洋紡のCan Get Signalを使ったことはありますか？

(無題) 削除/引用 No.12482-9 - 2024/08/02 (金) 11:40:10 - wwn あの様 ゲルは 富士フイルム和光のSuperSep 泳動槽は Daiichi Pure Chemicals, DPE-1020 電源は Bio-Rad, Power Pac Basic です。 iBindですが、溶液を入れる部分が複数形状がありまして、1種類だけでなく、同時に2種および6種の抗体セットに対応できる様になっています。(ミニゲル1枚ならこの半分が対応することになる) しかし、この6種類用のものは使った事がないです。(使いどきが浮かばない) 2種の膜に対して別々の抗体を同時に反応させた事がありますが、混ざり合う事はなかったです。 *境界あたりは避けるように膜を置いています。 ミニゲル用の膜を染めるのに2ml使用します。抗体濃度はメーカー推奨の濃い方を勧められています。 メーカーに記載のない場合はとりあえず1000倍希釈で使用しています。 化学発光の試薬、検出器の感度次第でこのあたりについては変えられると思います。

(無題) 削除/引用 No.12482-8 - 2024/08/02 (金) 07:28:07 - Biorad うちもBiorad 結果自体はバックが汚いわけでもなく 曲がるとしてもPAGEの時点で歪むだろうし バンドの濃淡調整は検出機に依存する。 一応他メーカーのゲルでも使えるし 転写のみに関して言えば１カセット7分で済む（内臓の選択式設定による） 気になる点は洗いメンテナンスで カセット上部内側がバネ？みたいなスキマに水が入る構造 でも水を切って1時間くらいドライシェルフに入れとけば垂れないくらい乾くし 気にしなければ濡れてても感電しない構造にはなっているだろう もし一回ごとに洗わないと気持ち悪いというなら カセット単独でも売ってる。 多人数で数こなすなら 泳動もwashもそれぞれでやって 転写数分が被ってもめることはまずないだろう。 タッパーでもトレイでも液捨てはデカントで済むし 抗体もケチれば袋に入れてもいい 転写独立でやるならシステム自体安く済む なによりもう夏のキャンペーンが終わるから 比較するまでもなくキャンペーン価格は他の通常より安かろう 今日発注して適用されるか確認はしておかないと https://www.bio-rad.com/ja-jp/life-science-research/promotions 全自動のは少人数で他事もやるなら楽できそう SNAPidは現物があったから見てみたけど 吸引で染めの時短ができたとしても半分程度？ 転写から1時間で完結するくらい早いなら自動もありだけど

(無題) 削除/引用 No.12482-7 - 2024/08/02 (金) 00:26:43 - と TransBlot Turbo, iBindの組み合わせで使用していました。 iBlotは汎用性がなさそうなので、ゲル、メンブレン、バッファーの組み合わせを自由に選択できるかと思いTransBlot Turboを選択しました。特に問題なく十分に転写できていました。 iBindはかなり金食い虫ですが、一度使用するとやめられません。セットしてしまえば後は放置。翌日まで放置も可能です。一台につき一抗体なので、複数の抗体で同時に行うには台数も必要で、奪い合いでした。 結果も手動でやるよりも良いことが多かったです。簡便で気をつけるポイントも少ないので、補助員の方などに行って貰う場合も指導が楽で、比較的安定した結果を得られると思います。ただ教育目的もある場合は通常の方法での手技を会得してから、時短のためにiBindを利用する方が良いと思います。iBiindでうまくいかない場合（転写まではうまく行っている前提）、抗体濃度くらいしか検討余地はありません。専用のブロッキング溶液しか使用したことはないため、自作のブロッキング溶液でうまくいくかはわかりません。 参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.12482-6 - 2024/08/01 (木) 22:50:31 - たこ Transblotユーザーです。 ゲルはBiorad TGX precast gel, メンブレンはImmobilon E, 転写バッファーはTris-Gly-MtOHです。 院生の頃数年使っていて、昨年から十年ぶりまた使い始めましたが、特に不都合は生じていません。 当時は自作の10％ゲルを使っていましたが、確か15分くらいで150 kDaまでは転写できていたような記憶があります。 より確実に転写したい場合は３０分かな。 anode buffer, cathode bufferを使う後輩はより綺麗に転写できていたような・・・ 短気な人はMtOH10％やらCAPS入りのbufferで高速転写やっていた気がしますが、確か上手くいっていたはずです(責任は持てません)。 ミニゲル以外のサイズと言っていいかわかりませんが、最近よく泳動後にミニゲルを数レーン分, せいぜい６レーン程度だけ切って転写しています。 無論何の問題もなく転写できていますし、データもちゃんと出ます。 学生が多いところだったせいか、カセットのふたを落っことして、あの緑のネジのつまみがバカになったことがあります。 取り扱いにはお気をつけください(当たり前か・・・)。 SNAPidはデモをやりましたが、抗体の使用量だったりがネックになって結局買わずじまいでした。 洗浄だけに使うことも可と若干食い下がられましたが、それならSNAPid使わず普通に洗えばいいよねという・・・

(無題) 削除/引用 No.12482-5 - 2024/08/01 (木) 21:12:25 - バチラス あの様 ありがとうございます。あの様も含めてトランスブロットターボについては使用者の皆さんからの評判は良く、一番無難な選択であると改めて感じました。スゴクいい！という意見はあまり聞かないのですが、普通に使いやすくて結果も安定しているので特に不満はないというご意見が多いです。「普通に使いやすい」はルーチンワークに使う装置には重要な点であると思います。 wwm様 ありがとうございます。iBlotとiBindは私の周りに利用者がいないため、とても参考になりました。ランニングコストは高いものの、wwm様のコメントからメンテ・速さ・結果の安定性において非常に良いツールであることが伝わりました。iBlotとiBindがセットで購入できれば飛躍的に楽になるのですが、予算の都合上、購入するにしてもどちらか一方しか買えず、非常に残念です。。ブロットを迅速にできればと思っていたのですが、一方で抗体反応も一次・二次とWashまで含めるとかなり手間がかかるプロセスで、このプロセスを自動化してくれるiBindが魅力的に感じました。 皆さま 引き続きおすすめの機器などあれば教えてもらえると助かります。よろしくお願いします。なお、最初の書き込みで「候補装置は3つある」と書いてしまいましたが、これは私の誤りで正しくは末尾に挙げている通り「4つ」です。失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.12482-4 - 2024/08/01 (木) 19:06:49 - あの Wwnさん レディメードゲルや、泳動槽、電源は、どこのメーカーのものをお使いですか？

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