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(無題) 削除/引用 No.12475-34 - 2024/07/31 (水) 10:37:16 - seventh 一過発現実験と安定クローンラインの確立とそれを使った実験の話が混ざっているような気がしますが。 安定クローンラインの場合、その細胞株ライン（形質転換系統）がその培養・実験条件ではコントロールに対して安定してN%発現上昇orN%にターゲットをKDというのを前提として示す必要があります。 M1さんはそれを示すために実験を行おうとしているのではないかと妄想しますが、実験目的が提示されていません。 M1さんの元質問は何を示すために実験を行うのかの想定が曖昧になっているようです。実験目的のところからできる限り情報を出したほうが具体的な回答が来ると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.12475-33 - 2024/07/31 (水) 01:49:39 - おお >[Re:31] Greyさんは書きました : > > それはちょっと危険な考え方ではないですか？どこに入っているかわからないわけですよ。 > > マスをとって調べれば平均されランダムに挿入されたとみなしていいのではないでしょうか？ > > 1回目のKDと2回目のKDで集団として挿入箇所に偏りができるとは考えにくいのですが... たとえば1回目のKDが、あなたの追っている現象に深く関わる遺伝子上に挿入があって、２回目でそうでなければどうなりますか？ただし、それぞれクローンを拾った場合。クローンを拾わない場合はある程度納得行くが、その場合においてはコメントを追加しましたのでそちらを。

(無題) 削除/引用 No.12475-32 - 2024/07/31 (水) 01:25:42 - G25 > ３つ以上クローンを拾って三回実験を行うのは正攻法と言えますが、それより１つのクローンでいいので、KDまたはKOした遺伝子を発現させてみるとか、KDまたはKOした細胞でなくてもOverexpressionなどで逆の結果が得られるとか、要するの他の実験で全体的にみてKDまたはKOした細胞で見られた現象がKDまたはKOしたために起こったもであることが示せるならそれでいいと思います。 それは論点がずれていて、ある計測に統計手法を使う時、どうすべきかということとは無関係。 どういう母集団を想定してなにを証明しようとしているか、統計を使うならその前に説明できなきゃ嘘だよね、ということ。 それなしに表面的な数字の扱いをああだこうだ言っても無意味

(無題) 削除/引用 No.12475-31 - 2024/07/31 (水) 01:19:02 - Grey > それはちょっと危険な考え方ではないですか？どこに入っているかわからないわけですよ。 マスをとって調べれば平均されランダムに挿入されたとみなしていいのではないでしょうか？ 1回目のKDと2回目のKDで集団として挿入箇所に偏りができるとは考えにくいのですが...

(無題) 削除/引用 No.12475-30 - 2024/07/31 (水) 01:17:42 - おお >[Re:27] おおさんは書きました : > >[Re:24] Greyさんは書きました : > > G25さん、 > > レンチKD細胞は挿入部位に関してポリクローナルなので、 > > それはちょっと危険な考え方ではないですか？どこに入っているかわからないわけですよ。 > あ、レンチの場合別にクローンを拾わないということですか？それならある程度は納得できます。しかしやはらKDした遺伝子によって起こる現象であることは他の実験で示していかないと説得力がないと思います。

(無題) 削除/引用 No.12475-29 - 2024/07/31 (水) 01:15:18 - Grey おおさんの例はTechnical replicateで、これはBiological replicateとはちがいますよ。遺伝子KDに対応するある生物量の変化が有意かを知るには後者が必要だと思います。

(無題) 削除/引用 No.12475-28 - 2024/07/31 (水) 01:12:52 - G25 >[Re:24] Greyさんは書きました : > G25さん、 > レンチKD細胞は挿入部位に関してポリクローナルなので、異なる細胞群を3回サンプリングすれば3回KDを行ったときと似た個体差の分布が得られると仮定してよいと考えています。 > 一方、CRISPR -KOの場合はクローン差が無視できないので、複数クローンの結果を示すのが普通のようですね。 それでコンセンサスが得られるならいいと思います。 知らんけど

(無題) 削除/引用 No.12475-27 - 2024/07/31 (水) 01:11:58 - おお >[Re:24] Greyさんは書きました : > G25さん、 > レンチKD細胞は挿入部位に関してポリクローナルなので、 それはちょっと危険な考え方ではないですか？どこに入っているかわからないわけですよ。 > 一方、CRISPR -KOの場合はクローン差が無視できないので、複数クローンの結果を示すのが普通のようですね。 どちらにしろ複数のクローンで確認することがベターではあります。わたしなら２つクローンを用意して同じ傾向があるか確認します。３つクローンを拾って一回の実験で統計処理をするという話もありますが、その実験も３回繰り返して再現性を取るべきですから、後者と前者は視点が違います。 ３つ以上クローンを拾って三回実験を行うのは正攻法と言えますが、それより１つのクローンでいいので、KDまたはKOした遺伝子を発現させてみるとか、KDまたはKOした細胞でなくてもOverexpressionなどで逆の結果が得られるとか、要するの他の実験で全体的にみてKDまたはKOした細胞で見られた現象がKDまたはKOしたために起こったもであることが示せるならそれでいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.12475-26 - 2024/07/31 (水) 01:07:26 - G25 >いや思想の問題だと思います。多様性を追求するべき実験かどうかという点において。 どういうモデルで何を証明しようとしているのか、整合性があれば別に構わない。 そこんところの説明と説得力

(無題) 削除/引用 No.12475-25 - 2024/07/31 (水) 00:51:02 - おお >[Re:23] G25さんは書きました : > > しかし、それをもって、コントロールとKDに差があるとかないとかいうのは筋違いということです。 > なぜならKD標本の多様性を反映しているわけでないからです。 > > たびたびもうしているようにどのようなモデルでなにを証明しようとしているか、単なる数字遊びじゃなくて思想にすべき問題です。 いや思想の問題だと思います。多様性を追求するべき実験かどうかという点において。

(無題) 削除/引用 No.12475-24 - 2024/07/31 (水) 00:38:24 - Grey G25さん、 レンチKD細胞は挿入部位に関してポリクローナルなので、異なる細胞群を3回サンプリングすれば3回KDを行ったときと似た個体差の分布が得られると仮定してよいと考えています。 一方、CRISPR -KOの場合はクローン差が無視できないので、複数クローンの結果を示すのが普通のようですね。

(無題) 削除/引用 No.12475-23 - 2024/07/31 (水) 00:29:38 - G25 > 例えばコントロールのcDNA溶液とKDのcDNA溶液（それぞれチューブ一本）で、それぞれ対象の遺伝子のcDNAの量がどれくらいあるかを調べるとします。それぞれのチューブから３回とってqPCRをして平均を取るという行為はチューブ内の対象cDNA量の近似値をとるということで、数値の正確性を追求するための方法です。また、それらのチューブ間で対象cDNAの量に差があるのかということ（差がないというnull hypothesis）を統計的な有意差をもって示すことができます。これに対し統計的に間違っている理屈は私はないと思います そういうことに関しては、ある一標本のより妥当な測定値を求めるためのレプリケートということで否定はしていなかったつもり。 しかし、それをもって、コントロールとKDに差があるとかないとかいうのは筋違いということです。 なぜならKD標本の多様性を反映しているわけでないからです。 たびたびもうしているようにどのようなモデルでなにを証明しようとしているか、単なる数字遊びじゃなくて思想にすべき問題です。

(無題) 削除/引用 No.12475-22 - 2024/07/31 (水) 00:15:37 - おお >[Re:9] G25さんは書きました : > >で回答されている皆さんにも聞きたいのですが、kdの確認でそこまで厳密に独立した実験で統計処理を追求しないといけないものでしょうか？ > > > 統計解析、有意性検定をもとになにかを言おうとするなら、 > ちゃんと統計学のプロトコールに則るべきじゃないですか。 > プロトコールはないがしろにして統計学の恩恵だけイタダキというのはズルです。 > > KDの確認ができればいいというくらいの扱いなら統計なんか必要ない。見たままの測定値で効いているか否か判断したらいいようなもの。 > では個人的見解をかいておきます。 例えばコントロールのcDNA溶液とKDのcDNA溶液（それぞれチューブ一本）で、それぞれ対象の遺伝子のcDNAの量がどれくらいあるかを調べるとします。それぞれのチューブから３回とってqPCRをして平均を取るという行為はチューブ内の対象cDNA量の近似値をとるということで、数値の正確性を追求するための方法です。また、それらのチューブ間で対象cDNAの量に差があるのかということ（差がないというnull hypothesis）を統計的な有意差をもって示すことができます。これに対し統計的に間違っている理屈は私はないと思います。”統計学の恩恵だけイタダキ”といいますがやったことをちゃんと書いておけば別に”統計学の恩恵だけイタダキ”ではないと思います。明記しないでどうやっているかわからないので、”統計学の恩恵だけイタダキ”と思えると言うのはわかります。 しかしながら、例えばコントロールのcDNA溶液とKDのcDNA溶液（それぞれチューブ一本）でやったときは再現性を示しているわけではありません。この点に関してはその後いろいろな実験の際にそれぞれのサンプルでKDされていることを示しながらデーターを取るなら、そういうデーターを持って再現性あるといえばいい話でもあります。 いちいち樹立した細胞株でKD確認で３回RNAをとって統計的に再現性を確認して、KDされている細胞を選ぶだろうかということです。ただし、１回の実験で変なデーターがでてあたかもKDされているように見えるということはあるかもしれません。そのあたりをどうするかは実験者個々で判断すればいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.12475-21 - 2024/07/31 (水) 00:10:08 - G25 siRNAはそもそもトランスフェクション効率が一定にコントロールできないし再現もできないというところが違うかなあ。コントロールできないところは原理的に内包されるばらつきとして処理する、、 ていうか人に問う前に自分がどういうモデルでどうやっているかを考え、説明するのが先じゃねえか。 怠慢だぜ。あなたはどういう考えでそれをやるのか？ 私も統計は訳わからない部類。 でも機械的に何をどうすればいいというものではなく、その人のモデルなり仮説なりが意識されねば空虚だということは悟った。

(無題) 削除/引用 No.12475-19 - 2024/07/30 (火) 23:39:58 - Grey > 同じ培養皿から取った細胞を分割してn=3とすること はありません。G25さんのおっしゃる通りです。 G25さん、siRNAのときは3回独立にKDを行いますが、これとレンチKDのちがいはなんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12475-18 - 2024/07/30 (火) 22:55:35 - G25 > 正直なところ、同株で3回行い統計処理したものを論文に使ったことはあるでしょうか 同株でn=3ということが問題なんじゃなく、平たくいうと同じ培養皿から取った細胞を分割してn=3とすることが問題なんです。本来それはn=1にしかなりません。 同じ細胞株を独立して培養した3皿をそれぞn=1とするのは真っ当。 n=1の値を定めるために、一皿からreplicateを取るということを測定方法のポリシーとして決めるのは自由だけど、n=1にしかならない。

(無題) 削除/引用 No.12475-17 - 2024/07/30 (火) 22:08:55 - fg G25さん ありがとうございます。 研究不正の教育はありましたが、ビデオやレクチャーがメインで、直接教官から口酸っぱく言われるようなことは無かったので大変勉強になりました。 Greyさん 正直なところ、同株で3回行い統計処理したものを論文に使ったことはあるでしょうか。答えにくいかもしれないのですが、この問題に関して皆様のご意見を聞きたいと思っております。

(無題) 削除/引用 No.12475-16 - 2024/07/30 (火) 21:27:24 - G25 当初の手法は誤りでしたが正しい手法でやり直しても結果は変わりませんでしたというなら、訂正記事を出せばいいだけでしょう。 正しい統計手法を当てはめたら結果がひっくり返りましたというような場合は、錯誤により論文撤回下げとなるだろうけど、研究不正とまでは言われないでしょう。 まあ、今の時代、統計に厳しくなっているからこそ、ありがたいことに変な統計をやってると、エディタ、レフェリーに指摘されて、そのまま世に出ることはまずなくなっている。 意図的にデータや統計をいじって主張の根拠にするのはアウトですけど。 てか、研究不正とはどういうものかというのはコンプライアンス教育でどこでも厳しく指導してるんじゃないの？

(無題) 削除/引用 No.12475-15 - 2024/07/30 (火) 21:09:58 - Grey G25さん、これまで同株で3回行い統計処理していました。 遺伝子gの量と効果量Eとの間に因果関係があると考えたとき、gは特定の値g=g0（同株比較）でEを3度測定し対照株のE’と比較すれば良いのか、g=g1, g2, g3のそれぞれでE1, E2, E3を測定し（3回KD）、それらが対照株のE=E1’, E2’, E3’と有意差があることを示せばいいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12475-14 - 2024/07/30 (火) 21:08:41 - fg G25さん 最近は統計にどこも厳しいですよね。 アクセプトされ、論文が通ってしまったあとに発覚した場合、どうでしょう？ 研究不正になるとお考えですか？

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