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(無題) 削除/引用 No.12474-5 - 2024/07/31 (水) 07:51:06 - s sgRNA導入細胞として、実験をしてもよいと思います。 ウエスタンでバンドが少しでているがsgRNA導入として実験をしている論文はよくみかけます。イメージとしてはpermanantノックダウンです。

(無題) 削除/引用 No.12474-4 - 2024/07/30 (火) 20:00:44 - toto 抗体のノンスペでないとしたら、wildの細胞が少しコンタミンしてるのでしょう。割とあります。それだとすると、その細胞からserial dilutionして、シングルコロニーを拾ってクローニングしなおせばいいです。あれやこれややるよりは結局早いことも多いので。 ただ、もう少し継代を続けてそのバンドが薄くなっていくのであれば、単にwildの死細胞や残骸がくっついてるだけかもしれません。細胞の種類によって、たまにそういう細胞もあります。 配列確認はNGSでやらないとそのレベルでは区別つかないと思いますが、それでやっても、おそらくwildのリードが数本だけ出てくるくらいで、その問題解決には余りならないかもしれません。ただどういう削れ具合かは知っておいた方がいいとは思いますが。

(無題) 削除/引用 No.12474-3 - 2024/07/30 (火) 16:15:38 - あ 情報と確認が足りない。 隣のレーンの漏れかもしれないならレーンを離して電気泳動し直すべきだし、クローニングでシングルクローンになってなくて混ざっているのかもしれないならリクローニングし直すべきだし、せめてシーケンスはしましょう。

(無題) 削除/引用 No.12474-2 - 2024/07/30 (火) 15:25:24 - おお 判断は難しいです。いろいろなことが起こりうるので。indel でフレームが合っていても安定性(mRNAかタンパク)が極端に低下していればそういうことが起こっても不思議でもないし。 場合によっては隣のウェルに微量だけど入ってしまう事もある。ノンスペも否定する材料に乏しい。 やり直しよりも、ゲノムの配列を読まないと解決しないかもしれない。ノンスペだとすると毎回そこにバンドが出るわけで、それなのにノンスペと言い切る材料がないなら何回やっても結論が出ない。 複数のクローンでKOができたようですが、全てそうですか？ 最適な検出条件でバンドがでなければ、検出限界以下で発現してないと考えて実験するのもありと思いますが、非常に微量発現している事がどの程度影響が有りますか？

Crispr-Cas9で作ったKOのセルラインで完全にタンパクが消えない 削除/引用 No.12474-1 - 2024/07/30 (火) 05:41:42 - クリスパー お世話になります。 ある遺伝子のkOを癌のセルラインで作りました。 ゲノムは読んでませんが、ウエスタンでスクリーニングをし、複数クローン、バンドを認めなかったものを選出しました。 しかし、その抗体と別のものを認識する抗体を混ぜてプローブしたことがあり、もう一方(低発現分子です)の分子に合わせてXrayにかなり長く結果を焼いていたら、KOしたレーンにも微かではありますが、WTと同じ高さにバンドが出ていました。 KOではないのか、あるいはコンタミか、あるいは抗体のノンスペが考えられますが、4倍体の細胞と言われているもので、かりにKoが完全ではなかったにしろ、25%ならそこそこの強さで持って検出されてもいいのではと思ってしまいます。 やはり作り直しでしょうか。

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