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(無題) 削除/引用 No.12473-15 - 2024/07/29 (月) 10:15:55 - コロコロ 菌の持ち込みが多すぎてPCRに失敗するようでしたら、一度水に溶かすのを勧めます。 少量の純水を入れたプレートやチューブにコロニーを突いたチップを入れ、その水をPCRのテンプレートにします。 あと、クルードサンプルになるのでExtensionの時間を長めにしたほうがよいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12473-14 - 2024/07/29 (月) 09:51:12 - toto コロニーPCRもKOD Oneで５uLでやってますが、うまくいかないことはほぼないです。ただ、tubeの蓋がしっかり閉まってなかったときに量が減ってたことがあり、またマシンによって蓋を押さえつける強さが弱いと量が減りがちで、そういうときは当然ながら反応液量が少ないときには特にうまくいかないことがありました。 メーカーの回し者ではないですが、昔のＰＣＲと違って、KOD Oneではほぼ外れがないので（長いフラグメントでない限りは）、最近ではクローニングのチェックでも制限酵素でなくPCRを使うようになってます。安くすむというのもありますが、簡単で速いので。2.5uLでやる事もありますが問題なく使えてます。

(無題) 削除/引用 No.12473-13 - 2024/07/28 (日) 17:07:45 - おお まあ、できないというより、わざわざプライマーをそれように2000作るのは敬遠した方がいいと言う判断ですね。ただ、どんないい酵素でもアンプリコンが長くなると多少なりとも成功率は低くなります。

インサートの配列が2000個すべて違う 削除/引用 No.12473-12 - 2024/07/28 (日) 15:39:18 - boooooo ので、短い配列を増やすことはできません。

(無題) 削除/引用 No.12473-11 - 2024/07/28 (日) 14:51:13 - おお あの、インサートが長いのは仕方がないのですが、インサートの配列とベクターの配列でプライマーを作り、短いアンプリコンにした方が成功率上がりませんか？

(無題) 削除/引用 No.12473-10 - 2024/07/28 (日) 14:23:01 - おお 10ulでやってます。

GoTaq 削除/引用 No.12473-9 - 2024/07/28 (日) 14:14:13 - boooooo 安いです 10ulもしくは５ulの系でうまくいきますか？

(無題) 削除/引用 No.12473-8 - 2024/07/28 (日) 14:00:03 - おお プロメガGoTaqとかそちらでは安くないですか？

KODoneでいま5ulでやっています 削除/引用 No.12473-7 - 2024/07/28 (日) 13:51:13 - boooooo KODoneは今5ulでやっていますが、時々うまくいきません。 やはり10ulできれば20ulでのPCRが良いような気がしています。 コロニーがチップの先にたくさんついてしまうと上手くいかないと何かに書いてありました。培地に一度チップの先をつけてからＰＣＲチューブに入れていますが、それでも5ulだと上手くいかないことがあるみたいです。 今はKODoneのセールやっているので、KODoneでやってしまうというのも良いかもしれませんがね。 ありがとうございました。

インサートチェック 削除/引用 No.12473-6 - 2024/07/28 (日) 13:48:21 - boooooo 2000のサンプルはインサートチェックした後にプラスミドを抽出しないといけません。まとめてPCRをすると目的のインサートが入っていることが確実にはわからないのでダメだと思います。でも少し考えてみます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12473-5 - 2024/07/28 (日) 10:41:47 - G25 例えばKOD Oneで10 uLで反応してもコスト高いですか？ KOD Oneは2xで最小容量5 mL, 10 uL反応で1000回分。 私のところでは酵素別添のKOD FX Neoで酵素1 uLあたり10 uL反応で10サンプルほどコロニーPCRして泳動チェックとシークエンス解析に供しています。 最小容量200 uLあれば2000反応できる計算です。 ただし、2xバッファや dNTP mixは買い足さないよいけないかも。 うちはいつもスケールダウンで使っているので、バッファやdNTPは余剰が出るので間に合ってますが。

(無題) 削除/引用 No.12473-4 - 2024/07/28 (日) 10:25:24 - poooool 質問に対する回答ではないのですが、2000サンプルのコロニーPCRとは大変ですね。PCR産物のサイズの変化をみたいということですか。それともインサート特異的バンドの有無ですか。後者であれば複数クローンをプールしてsibselectionするのはどうですか。

電気泳動は大丈夫です 削除/引用 No.12473-3 - 2024/07/28 (日) 09:47:39 - boooooo 96サンプル同時に流せる泳動漕が4つあるので大丈夫です。 でも定量PCRは思いつきませんでした。 KAPAより安いのどなたかお使いでないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12473-2 - 2024/07/28 (日) 09:40:25 - あの 自分ではまだ使ったことありませんが、次あたりはどうですか？ 商品 https://n-genetics.com/products/detail/KK3606/ これの使用事例は https://up.n-genetics.com/categories/application/2271/ ところで、アガロース電気泳動を2000以上やるのは大変そうです。クルードサンプルに使えるサイバーグリーンのquantitativePCR 酵素キットの安そうなものも検討したらどうですか？それでも96ウェルプレート20枚以上ですが。

コロニーPCRを安価でやるためのDNApolymeraseを探しています 削除/引用 No.12473-1 - 2024/07/28 (日) 09:13:39 - boooooo コロニーPCRを2000サンプル以上やる必要があります 今まではKODone（Toyobo）を使っていましたが、高いので酵素を変えたいです。 Blend Taq（Toyobo）が良いかと思いますが30ulの系でやるようにと書かれています。 バイオアカデミア(株) のTaq（Taq DNA ポリメラーゼ(+ dNTPs), with Robust(強力) Buffer）などは安いですし、伸長速度もよさそうですが 安い酵素で、成功率も高い酵素を教えて頂けませんでしょうか？ インサートは平均1.5kbp最大で3.5kbpくらいなので、伸長速度が1kbあたり30秒くらいのものが望ましいです。 昔は自作でtaq作っていましたが保存していると活性が落ちたので最近は作っていません

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