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(無題) 削除/引用 No.12469-7 - 2024/07/29 (月) 10:18:04 - あ EGFPとEYFPは酸性側(〰4.5)で蛍光がほぼ完全に焼失しますが、CFPは暗くなるだけで残ります。中性に戻すとまた蛍光はほぼ100%に戻ります。 GFPがpH indicatorとして使われるのはこの特性を利用しています。GFPバリアントによって異なるのでお使いの配列で確認した方が良いですが、目的の用途には酸処理は使えないと思います。レーザーでブリーチして染色したらどうでしょうか

(無題) 削除/引用 No.12469-6 - 2024/07/28 (日) 22:08:38 - 独り言 エタノール固定で消えた気がします。 ただ、共局在とか重要な実験であれば、消失し損ねたものをたまたまとらえてしまったとかぬぐえないので、私なら怖くてやりません。（GFPが細胞質全体に光るとか、単に光っているのを確認するぐらいならいいかもしれないが）。

(無題) 削除/引用 No.12469-5 - 2024/07/28 (日) 18:51:46 - ossi 過酸化水素で非可逆的にブリーチできます。 例えば、 https://star-protocols.cell.com/protocols/3587

(無題) 削除/引用 No.12469-4 - 2024/07/27 (土) 00:17:57 - おお 普通にPFAなどの固定でかなり退色しますけど。GFPで特定細胞を光らせたマウスの組織でGFPを検出するのにGFP抗体使うとかいうことをよく見てきました。他の固定法のほうがより有効かもしれないので予備的にやってみればいいかと思います。 発現量を調整するためにあまり強くないプロモーターをつかうとか、Transientならプラスミドにクローニングベクターなど混ぜてGFP発現ベクターの量を減らすとか言うのもできなくはないかと思います。そうすることで退色によりなるべく蛍光を抑えることが期待できます。 GFPは蛋白としては細胞内で非常に安定で、経時的な発現量などのReporterとして不向きなために、short half lifetimeのGFPとかもあったと思いますのでそういうのも高発現を抑えるのに有効かもしれません。 >質問3.CFP、GFP、YFP、RFP CFP、YFPはGFPからの変異体だったと思います。RFPはどうだったっけ。固定に弱いという話はありますが、特性が若干異なるかもしれません。 あれこれ書きましたが、固定を工夫するのがやっぱり早道かなと。

(無題) 削除/引用 No.12469-3 - 2024/07/26 (金) 22:44:36 - G25 蛍光タンパク質は一般的にアルコールやアセトンなど有機溶媒で褪色しやすいと言われています。 固定液や封入剤のアルコール、アセトン他有機溶媒、またカバーグラスをシールするマニュキュアのアセトンなんかも禁忌。それを逆手にとって、、

(無題) 削除/引用 No.12469-2 - 2024/07/26 (金) 20:56:45 - ema 本来の使い方では無いですが 自家蛍光消光装置　TiYO 大きめのブリーチングをするような機器で、注意書きに「染色前の前処理として行ってください。」とあるので使えるかもしれません。 デモの時戻るような色素の場合はと質問して「もし戻ったとしても3−4日は消えてます」という事です。

培養細胞に発現させたCFP,GFP,YFP,RFPの蛍光を退色させる方法 削除/引用 No.12469-1 - 2024/07/26 (金) 20:45:59 - nin 哺乳類培養細胞に対する蛍光遺伝子の導入と免疫染色の組み合わせた実験について質問があります。 培養細胞にCFP、GFP、YFP、RFP等をplasmidで遺伝子導入後、一度顕微鏡でライブイメージングにて観察。イメージング後に固定し、光ってる細胞達の蛍光を可能な限り消失させ、同細胞を蛍光免疫染色(細胞のマーカー抗体で緑、赤で染めたい)し、ライブイメージングと同じ視野で撮影したいと考えています。 質問1.plasmidで光らせた蛍光を効率よく消失する方法をご存知であればご教示いただきたいです。 質問2.GFPに関しては固定後にpHを酸性に傾けた場合蛍光が消失すると思うのですが、bufferを中性に戻した際はGFPの蛍光が再度出現するのでしょうか。あるいは、消失したままになるのでしょうか。 質問3.CFP、GFP、YFP、RFPはいずれも酸性に対して消失を起こすのでしょうか。 ご教示のほどどうぞよろしくお願いいたします。

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