全22件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

(無題) 削除/引用 No.12468-23 - 2024/08/07 (水) 21:11:39 - G25 > 精製したプラスミドは、制限酵素処理する前に空のベクターと比較して泳動しており、空のベクターと同様の位置にバンドは確認できていました。（ベクターが5000bp、インサートが1000bpほど）泳動の結果では空ベクターよりやや大きいかどうかまでは確認できず、ほぼ同じサイズでしたが、同研究室の方に聞いたところ、サイズが大きいのでこれだけでは入っているかどうか入っていないかわからない、とのことで、制限酵素処理に進んだ次第です。 制限酵素の処理して泳動するのは当然なんだけど、 未消化のcccでも5 kbと6 kbが見分けられないはずないんだけどなあ。 https://www.nippongene.com/siyaku/product/electrophoresis/tds/tds_onestep-ladder-sc-plasmid.pdf > ちなみに、genomic DNAの夾雑物であった場合、どのようなバンドがでるのでしょうか？ genomic (chromosomal) DNA はかなり高分子量のところに見えます。 https://www.researchgate.net/figure/Gel-electrophoresis-of-plasmid-DNA-extracted-from-SS1-using-the-XSP-buffer-method-lane_fig4_13443801 制限酵素の消化すると、量が多ければスメアに見え、少なければ分散して見えなくなります。

(無題) 削除/引用 No.12468-21 - 2024/08/07 (水) 01:41:44 - おお >[Re:20] まめさんは書きました : > >おおさん > > >使ったStrain名を開示できますか？ > 使った大腸菌はNEBのC3040です。 > この株は繰り返し配列のあるプラスミドのリコンビネーションが防げるように工夫されていて、そういうプラスミドを使うにあたって３０度ぐらいのほうが安定しているので３０度を推奨しているのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12468-20 - 2024/08/06 (火) 16:06:20 - まめ >おおさん コメントありがとうございます。 >普通は温度下げると減りますけどね。。。ということは殻のベクター自身が大腸菌の生理状態に影響を与えているのか、、、もしかして同じプロモーターが２つ使われているとかレンチやレトロウイルス用発現ベクターだったりしませんか？ そうなんですね…。 もしかしたらプラスミド抽出キットを新しくしたことも収量増加に関係しているのかもしれません。 プロモーターはみたところ1つのようで、CMV IEと記載があります。 色々調べていると哺乳類細胞用ベクターのようで、レンチやレトロウイルス用ではなさそうです。 >使ったStrain名を開示できますか？ 使った大腸菌はNEBのC3040です。 >長時間培養して増えてくる場合、イーストなどが増えてきている場合もあります。また収量が低い場合DNAが結合するべき条件でDNAがないわけですから、DNA以外の物が吸着してしまっている可能性が出てきます。また死菌などが増えている場合はゲノムのDNAの断片が精製されることもあるでしょう。 とても勉強になります。自分で調べてはいるのですが限界があり、周りに聞ける人がいないので本当に助かります。ありがとうございます。 おっしゃるとおり、長時間培養して回収したDNAは酵素処理すると毎回スメアになる為、イーストやDNA断片なのかもしれません。 ただ、それらも酵素処理する前には空のベクターと同様の位置にバンドがあったため、てっきり目的のプラスミドだと勘違いしてしまいました。

(無題) 削除/引用 No.12468-19 - 2024/08/06 (火) 03:14:15 - おお >[Re:18] まめさんは書きました : > 皆様アドバイスありがとうございます。 > > 「培養温度を30℃でやってみてはどうか」との意見をたくさんいただきましたので、先日、3mLの菌液を30℃で一晩培養し、新しいプラスミド抽出キットで抽出してみました。その結果、 > ・空のベクター→今まで70-80ng/uLしか精製できなかったところ400ng/uL精製できた 普通は温度下げると減りますけどね。。。ということは殻のベクター自身が大腸菌の生理状態に影響を与えているのか、、、もしかして同じプロモーターが２つ使われているとかレンチやレトロウイルス用発現ベクターだったりしませんか？ > ・InsertDNAをライゲーションしたプレートから培養した菌液からも200ng/uL精製できた よかったです。 > > コンピテントセルの情報をたどっていったところ、公式のサイトには37℃もしくは30℃、さらに30℃の方が好ましいと記載がありました…。 使ったStrain名を開示できますか？ > 今回30℃一晩で増えなかった菌液もあったので、それをそのまま48h培養したら菌が増えており、プラスミド抽出した結果、やはり以前と同様1-4ng/uLしかとれませんでした。上記同様制限酵素処理した結果、スメアになってしまいました。培養48hほどになるとプラスミドではない別の何かが増えているということなのでしょうか。 長時間培養して増えてくる場合、イーストなどが増えてきている場合もあります。また収量が低い場合DNAが結合するべき条件でDNAがないわけですから、DNA以外の物が吸着してしまっている可能性が出てきます。また死菌などが増えている場合はゲノムのDNAの断片が精製されることもあるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12468-18 - 2024/08/05 (月) 22:25:01 - まめ 皆様アドバイスありがとうございます。 「培養温度を30℃でやってみてはどうか」との意見をたくさんいただきましたので、先日、3mLの菌液を30℃で一晩培養し、新しいプラスミド抽出キットで抽出してみました。その結果、 ・空のベクター→今まで70-80ng/uLしか精製できなかったところ400ng/uL精製できた ・InsertDNAをライゲーションしたプレートから培養した菌液からも200ng/uL精製できた という結果がでました。 制限酵素でカットした際もスメアになることはなく、二本のバンドが確認できました。まだサンガーにかけてみないと分かりませんが、なんとか前進できた気がします。本当にありがとうございます。 あと、前任者に教えていただいたプロトコルでは、菌液は37℃で16ｈ培養とあったのですが、コンピテントセルの情報をたどっていったところ、公式のサイトには37℃もしくは30℃、さらに30℃の方が好ましいと記載がありました…。今後はしっかりと自分でも確認するようにします。 >たたたさん アドバイスありがとうございます。 配列毒性に強いコンピテントセルというものもあるのですね。 勉強になります。 また、培養温度についてもアドバイスありがとうございます。 >G25さん 本当に勉強になるアドバイスをいつもありがとうございます。 精製したプラスミドは、制限酵素処理する前に空のベクターと比較して泳動しており、空のベクターと同様の位置にバンドは確認できていました。（ベクターが5000bp、インサートが1000bpほど）泳動の結果では空ベクターよりやや大きいかどうかまでは確認できず、ほぼ同じサイズでしたが、同研究室の方に聞いたところ、サイズが大きいのでこれだけでは入っているかどうか入っていないかわからない、とのことで、制限酵素処理に進んだ次第です。 ちなみに、genomic DNAの夾雑物であった場合、どのようなバンドがでるのでしょうか？ 今回30℃一晩で増えなかった菌液もあったので、それをそのまま48h培養したら菌が増えており、プラスミド抽出した結果、やはり以前と同様1-4ng/uLしかとれませんでした。上記同様制限酵素処理した結果、スメアになってしまいました。培養48hほどになるとプラスミドではない別の何かが増えているということなのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12468-17 - 2024/08/02 (金) 10:22:27 - G25 >プラスミドの収量は1ng/μLほどしかありませんでした。試しに2日ほど培養してみたところ、菌量が増え、プラスミドの収量は4ng/μLほどに増えましたが、これは目的のプラスミドではない可能性が高いのでしょうか？ 一応、確認ですが、収量を吸光度などで定量するだけでなく、（制限酵素処理無しで）泳動もしているんですよね。インタクトのプラスミドサイズに矛盾がないかとか、RNA, genomic DNAの夾雑のチェックとかのために。 その結果はどんなもんでしたか？　サイズは妥当でしたか（空ベクターよりやや大きいバンドだったか）。 >前回、酵素がおかしいかもしれないといった書き方をしてしまいましたが、原因が酵素なのかDNAの精度なのか確認する必要があると考え、空のベクターで酵素処理してみたところ、スメアはでませんでした。よって、おそらく精製したDNAの精度が悪いと考えられます。 ちょっと恐ろしい想像をしてしまったのですが、 実はインタクトのプラスミドの泳動はしていなくて、制限酵素消化したものを泳動しただけとか？ 1 ng/uLとか4 ng/uLのプラスミドが取れたというのは吸光度の結果だけでで言っていてプラスミドの存在は確認していなかったなんてことは、、、 仮にそうだとしたら、プラスミドは全然とれてなくて、genomic DNAの夾雑物で、制限酵素でスメアになっていたのはそれだった、ということも、、、

(無題) 削除/引用 No.12468-16 - 2024/07/31 (水) 20:54:33 - G25 >NEB® 5-alpha F'I q Competent E. coli という配列毒性に強いコンピテントセルを使い 毒性に強いというのはlacI^qを持っているからPlac発現系のleakt expressionが防げるというのもですね。Plac支配下でなければ無力です。 因みにJMシリーズやXLシリーズはlacI^qだからlacZ誘導にはIPTGが必要。DH5αはそうじゃないからIPTGなしでlacZ発現が漏れるのでIPTGなしで青白セレクションできる。それにlacI^qを導入したのが紹介されている宿主株のようです。

(無題) 削除/引用 No.12468-15 - 2024/07/31 (水) 16:46:37 - たたた 配列毒性というものに当たっている可能性があると思います。 コンピテントセルを開示できますか？ NEB® 5-alpha F'I q Competent E. coli という配列毒性に強いコンピテントセルを使い、30℃培養してみるのも良いと思います。 また、プレートからコロニーをピックアップして抗生剤を加えないLB液体培地で30℃（常温でも良いです）で48時間くらい培養してみて増えるかどうか、プラスミドが取れるかどうか試してみると良いと思います。プラスミドを低コピーで保つことで培養に成功する場合もあります。

(無題) 削除/引用 No.12468-14 - 2024/07/31 (水) 10:14:03 - まめ >おおさん ありがとうございます。 上手くいかない原因がなかなか特定できないので苦戦しています…。 コンピテントのStrainも、許可がでるか分かりませんが、他の種類を試すなど検討してみます！ >G25さん 前回、酵素がおかしいかもしれないといった書き方をしてしまいましたが、原因が酵素なのかDNAの精度なのか確認する必要があると考え、空のベクターで酵素処理してみたところ、スメアはでませんでした。よって、おそらく精製したDNAの精度が悪いと考えられます。これはプラスミド精製キットの試薬に何かコンタミがあると考えるべきでしょうか…。別の研究室でプラスミド精製は何度も行っておりましたがこのようなことは初めてです。 使用した酵素はEcoR1 HFとNhe1 HFで、37℃15分→80℃20分で反応させた後電気泳動でチェックしています。本来インサートがあれば2本のバンドになる予定でした。 また、前任者に確認したところ、空のベクターが以前は200ng/μL（培養液3ｍL→最終溶液50μL）は取れていて、今年から50-100ng/μLほどしかとれていないことがわかりました。これによって、空のベクターの状態（コンピテントセルの影響なのか、精製の影響なのか）もあまりよくない可能性もでてきてしまい… とりあえず新しいプラスミドキットを注文して再度空のベクターも含めプラスミドを精製し直してDNAの状態をチェックしてみようと考えています。

(無題) 削除/引用 No.12468-13 - 2024/07/30 (火) 21:33:14 - G25 本当に、制限酵素がおかしいからだったのか？ DNAの精製度、反応条件なのでもスメアになり得るので。 因みにどんな酵素をどんな反応系で？

(無題) 削除/引用 No.12468-12 - 2024/07/30 (火) 05:06:05 - おお あまりこれといった根拠がないことが大抵なんだけどコンピテントのStrainを変えてみると改善したりすることもあります。

(無題) 削除/引用 No.12468-11 - 2024/07/29 (月) 16:59:02 - まめ >とさん コロニーPCRはまだしていないので、やってみようと思います！ >G25さん とれているものが正しいかどうか、2つの酵素で制限酵素処理→泳動でチェックしたかったのですが、制限酵素の調子が悪いようでスメアになってしまい、それを見せたところ最初からやり直して、ということになってしまいました。本日空のベクターも同様に酵素処理して流したところスメアになってしまったため、明日、使用しているどちらの酵素がおかしいのか調べようと思っています。できれば配列を読んでチェックしたかったのですが、コンタミだろうからということで却下されてしまいました。 酵素のチェックができ、配列を確認出来たら、スケールアップして培養したいと伝えてみます。 実用的な収率だと言っていただき安心しました。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12468-10 - 2024/07/28 (日) 07:12:30 - G25 つまり収量は 3 mL培養液から50 ngから200 ng 空ベクターなら3.5 ug てことですね。 空ベクタも通常のpUC系にしてはやや少なめかな。 収量が少ないにしても、取れているものは正しいのですよね。 でしたらそれだけの収率はあるんだから、単純にスケールアップして必要量取得するのでもいいのではないでしょうか。 pBR系など低コピー数のベクターの収率がそれくらい(pUC系の1/20〜1／30くらい)ですが、それを考えたら、実用的な収率でしょう。

(無題) 削除/引用 No.12468-9 - 2024/07/27 (土) 11:32:33 - と コロニーPCRは？ ライゲーションでモノ自体は出来てるんだよね

(無題) 削除/引用 No.12468-8 - 2024/07/27 (土) 08:14:18 - まめ 皆様コメントありがとうございます。 >qqさん 私もKan濃度が気になったので、Kan濃度を10、20，30μg/mLでやってみたのですが、差は見られませんでした。 インサートなしのベクターもminiprepしてみたのですが、そちらは液体培地でも問題なく増え、3ｍLから70ng/μLほど取れています。 >G25さん 宿主毒性があるプラスミドについて、勉強不足でした。過去トピも拝見して勉強してきます。 液体培地の培養温度について、次回は30℃でやってみようと思います。 >濃度を示したってそれは収量の記述にならんよ。 >何mL培養液から何ug取れたかを言わないと。 >濃度で言われてもスタートの培養スケールや最終溶液の体積がわからなきゃ収量、収率の見積もりはできん おっしゃる通りです。記載しておらず申し訳ありません。 培養スケールは3ｍL、最終溶液は50μLです。 なお、インサートなしベクターで同条件で培養したところ濃度は70ng/μLでした。 >おおさん ヘテロである可能性などもあるのですね。とても勉強になります。ありがとうございます。 ファージのコンタミについてもご教授ありがとうございます。インサートなしのベクターでも同条件でminiprepしているのですが、そちらは液体培地に移した後も問題なく増え、3ｍLから70ng/μL（最終溶液50μL）ほどとれていますので、やはりインサートが大腸菌に悪さをしている可能性が高いのでしょうか？ Kanの濃度は上述のとおり濃度別に試してみましたが差は見られなかったので、一度培養温度を30℃にして試してみようと思います。 それでもだめならプレート上で増やす方法も検討してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.12468-7 - 2024/07/27 (土) 01:04:22 - おお 液体培地で増やすとほんとに増えないケースってたまにあります。コンタミなら増えるけどプラスミドが取れないとそういう事になることが多いのではと思いますが、そこまでコンタミが起こったと思われるような事はあまりないです。ただコロニーは全体的に見ると一つのクローン由来と言えるかもしれませんが、ライゲーションしたものなどを形質転換したコロニーは大腸菌に一つのプラスミドが入っているわけでもありませんので（ライブラリーを作るときはこの辺はコントローるしないといけない）、厳密に言うとヘテロである可能性があります。そういうときはコロニーを線画培養してシングルコロニーを単離したほうがいいときもあります。ただこういうことが必要な場合は増えるけど、収量が低い要な場合でしょう。 ご質問のような場合、やはりプラスミドが大腸菌に悪さしている可能性が高いです。大腸菌用に発現ベクターでもないのにInsertの何某かの配列がたまたま大腸菌で機能してしまうような事もあるのだと思います。対処方法としては大腸菌内のプラスミドのコピー数を下げる工夫がよく取られます。培養温度を下げる、抗生物質の濃度を下げる（カナマイシンなら確か１５ug/ml程度まで下げれると記憶してますが、予備実験がいるかも知れません）などです。 どうしてもだめなら、プレート上で増やすという手も取れなくもないです。コロニーをLBなどで懸濁してプレートに塗ればいいです。ただし増えてくるに連れて死菌もまあまあ出てきますので、タイミングが難しいかもしれません。うっすら膜が張っているような感じがベストと思われます。ファージで使われているようなソフトアガーみたいなのでもいいでしょうけど。そんなにどろどろ感がない濃度のアガーを溶かしたLBで液体培地として培養するというプロトコールも見たことがあります。 ファージのコンタミであれば途中まで増えるけど増えなくなるとかになりそうですが。一度からのベクターとか並行してやってみればそのへんはクリアーになるかもしれません。インサートの問題なのか、その他培養液や環境の問題なのか。厳密にファージのコンタミを否定するなら、その増えないプラスミドを持った大腸菌の培地をフィルター滅菌して増えるであろうプラスミドを持った大腸菌の培地に加えればわかるとは思いますが、、、そこまでやる？って感じもします。

(無題) 削除/引用 No.12468-6 - 2024/07/26 (金) 22:30:25 - G25 インサートのコード配列が宿主に毒性があるのかもしれない。 プラスミドを保持した細胞はleaky expressionで死にがちのため殖えにくい。 pUC oriなら培養温度を30℃以下にしてみる。 細胞あたりのコピー数が本来の1/10程度(pBR ori 程度)になるが、死ににくくなって収量が上がるかも。 宿主毒性があるインサートのクローニングについては、過去トピ多数。 > プラスミドの収量は1ng/μLほどしかありませんでした。試しに2日ほど培養してみたところ、菌量が増え、プラスミドの収量は4ng/μLほどに増えましたが、 濃度を示したってそれは収量の記述にならんよ。 何mL培養液から何ug取れたかを言わないと。 濃度で言われてもスタートの培養スケールや最終溶液の体積がわからなきゃ収量、収率の見積もりはできん

(無題) 削除/引用 No.12468-5 - 2024/07/26 (金) 22:04:28 - qq Kanを30ug/mlから15ug/ml程度にすると良いかもしれない。（manualにはKan 50ug/mlと書かれているけど強すぎる感触です） インサートなしのベクターだけをminiprepしてみたらいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12468-4 - 2024/07/26 (金) 21:03:41 - まめ >G25さん コメントありがとうございます。 oriはpUCでした。 調べるとpUCはColE1の改良系と書いてあったので、ColE1系（コピー数が低い？）ということなのでしょうか？ >qqさん コメントありがとうございます。 ベクターはpIRES2 DsRed-Express2です。 説明書にはKan耐性ありと書いてあるので、おそらく大丈夫かと思うのですが…

(無題) 削除/引用 No.12468-3 - 2024/07/26 (金) 20:45:54 - qq clonetec/takaraのpIRESなら、AMPrだと書かれている。 Kanでセレクションであっているの？

全22件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---