Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る | トピック一覧 | 研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム(readのみ)

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

CTAB法の トピック削除
No.12464-TOPIC - 2024/07/24 (水) 18:20:59 -
CTAB法によって樹木(スギ)からDNA抽出をしているものです
粉砕→CTAB・βメルカプロエタノール添加→...から1回目のLiCl添加後、冷凍庫でインキュベートして4℃で遠心をするという流れで、ここで沈殿がある程度は出るのですが、冷凍庫から取り出した段階で液が黄色く、遠心しても沈殿が出ないサンプルが出て困っています
そもそもほとんど凍っておらず、粘性が明確に高く思えるのですがこの原因についてご意見をいただけないでしょうか



まじで頼む。
 
- このトピックにメッセージを投稿する -



9件 ( 1 〜 9 )  前 | 次  1/ 1. /1


(無題) 削除/引用
No.12464-9 - 2024/08/03 (土) 10:40:08 - れっど
すみません、掲示場所を間違えました・・
気にしないでください。

(無題) 削除/引用
No.12464-8 - 2024/08/03 (土) 10:05:48 - れっど
関東在住の20代学生です。
いつもよく拝見させていただいています。

大腸菌クローニングのブルーホワイトセレクションについて質問させていただきます。

LacZ内のMCSに目的遺伝子をインサートし、IPTGを添加して遺伝子の「発現」を誘導させますが、この際の遺伝子の「発現」とは、一般的には大腸菌宿主ゲノムのT7ポリメラーゼを誘導させるという考えでよいでしょうか?
それともLacZ遺伝子を誘導させるのでしょうか・・?

初心者の質問で申し訳ありません・・
ご指導いただけますとありがたいです。
何卒宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用
No.12464-7 - 2024/07/25 (木) 17:03:22 - seventh
スギ、ヒノキなんかはラフにでも核精製・細胞質成分除去をしたほうが良い結果になることがあります。
下のキットはカラム精製ですが、CTABフェノール精製でも夾雑物除去には核精製は有効です。

ISOSPIN Plant DNA
https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isospin-plant/isospin-plant-dna.html

(無題) 削除/引用
No.12464-6 - 2024/07/25 (木) 16:31:04 - おお
LiCl使うけど、加えた後に遠心しないで次に進むプロトコールもあるね。
https://link.springer.com/article/10.1007/s10528-023-10496-5
LiClはカオトロピックな作用があるから、抽出は効率を上げるのにも有効なのかもしれない。

(無題) 削除/引用
No.12464-5 - 2024/07/25 (木) 01:01:51 - おお
実験するときにその基本プロトコールは原理、詳細、バリエーションなどしっかりと解説があるプロトコール集を手に入れて読んでおくことを勧めます。手順をそのままやればできるといえばそれまでですが、うまくいかなかったとき改善とかの工夫などアイデアも浮かばないようでは実験を進められなくなってしまいますので。まあキット化されて何やっているかわからないものもあるにはありますが。

(無題) 削除/引用
No.12464-4 - 2024/07/25 (木) 00:56:45 - おお
>[Re:1] ぼさんは書きました :
> CTAB法によって樹木(スギ)からDNA抽出をしているものです
> 粉砕→CTAB・βメルカプロエタノール添加→...から1回目のLiCl添加後、冷凍庫でインキュベートして4℃で遠心をするという流れで、ここで沈殿がある程度は出るのですが、冷凍庫から取り出した段階で液が黄色く、遠心しても沈殿が出ないサンプルが出て困っています

沈殿にはRNAが含まれるはずですが、あまりRNAがないか分解が進んでいる可能性があります。そういう観点ではDNAを精製するには沈殿の有無はあまり影響がないと思います。粘性が高くて沈殿ができないというのであれば少しスケールを上げてもいいかもしれません。色に関しては植物(生物全般ですが)はいろいろな色素を作っているのであまり気にしないでいいと思います。糖類とかその他あまり好ましい色素が含まれる場合はPVPで抱合して沈殿させるということもあるようですのでPVPを使っているようなプロトコールを探してみてもいいかもしれません。

> そもそもほとんど凍っておらず、粘性が明確に高く思えるのですがこの原因についてご意見をいただけないでしょうか
>

多糖類という指摘がありますし、その可能性はあると思います。同時にゲノムのDNAの溶液は(断片化の程度や濃度によりますが)粘性が高くなります。その場合はちゃんと抽出されているとも見れると思います。それと凍らせるとかあまり意識しないでいいと思いますが、凍結しろとプロトコールに明記しているのでしょうか?凍結はgDNAのフラグメント化に寄与すると思います(まあ全然駄目になることはほとんどないです。ゲノムのライブラリーとか作るのでなければ)。

で結局DNAは回収できたのでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.12464-3 - 2024/07/24 (水) 20:41:14 - ema
https://www.naro.go.jp/project/results/laboratory/flower/2013/flower13_s06.html

https://keea.or.jp/pdf/knakyokanri/45/vol_45_10.pdf

結構大変そう。

(無題) 削除/引用
No.12464-2 - 2024/07/24 (水) 18:35:49 - 774R
>遠心しても沈殿が出ないサンプルが出て困っています
RNA含量が少ないだけじゃないですかね?困りますか?

>そもそもほとんど凍っておらず、
LiClを加えても凍らないと思いますが・・・

>粘性が明確に高く思えるのですがこの原因について
多糖類じゃないですか?

CTAB法の 削除/引用
No.12464-1 - 2024/07/24 (水) 18:20:59 -
CTAB法によって樹木(スギ)からDNA抽出をしているものです
粉砕→CTAB・βメルカプロエタノール添加→...から1回目のLiCl添加後、冷凍庫でインキュベートして4℃で遠心をするという流れで、ここで沈殿がある程度は出るのですが、冷凍庫から取り出した段階で液が黄色く、遠心しても沈殿が出ないサンプルが出て困っています
そもそもほとんど凍っておらず、粘性が明確に高く思えるのですがこの原因についてご意見をいただけないでしょうか



まじで頼む。

9件 ( 1 〜 9 )  前 | 次  1/ 1. /1


パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール   アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存(次回の入力の手間を省けます)
上に上げない(トピックの一覧で一番上に移動させません)
解決(問題が解決した際にチェックしてください)
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 

〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。