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WBで、流すプロテインの量の違いで移動度が変わる？ トピック削除
No.12456-TOPIC - 2024/07/20 (土) 08:51:06 - ウェスタン
よろしくお願いします。

ウェスタンブロット(WB)を行っているのですが、ウェルに流したしたサンプルに含まれる目的タンパク質の量の違いで泳動度が多少変わり、ブロット後のバンドの位置が5-10kDa程度違って見えるという事は有り得るでしょうか？

研究しているタンパクはある酵素で切断されることが知られています。タンパク50ng程度と酵素を反応させた後にWBすると、切断後のタンパクが30kDa程度のところに見れます。30kDaというのは、一緒に流したマーカーから判断しています。

これをタンパク12ugと酵素と反応させて同じようにWBを行ったのですが、切断後のタンパクが35-40kDa程度のところに見られるました。3回行ったのですが、結果はいつも、少量で反応させた場合に見られる30kDaのところよりも大きい位置に見られます。サイズ差が5-10kDa程度とそれ程大きい差では無いですが、確かに少量での反応でみられる30kDaより高い位置に見えるのは間違い無いです。

使っているゲルはNuPAGE Bis-Tris 4-20%です。泳動バッファはMES Bufferです。当然これらの条件や、また泳動時間もいつも一緒です。
　
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(無題) 削除/引用
No.12456-6 - 2024/07/20 (土) 21:02:40 - と
applyしているvolumeは同じでしょうか？
反応液中の試薬濃度の違いや蛋白以外の反応液のapply量の違いによる影響は考えられませんか？

(無題) 削除/引用
No.12456-5 - 2024/07/20 (土) 13:13:57 - qq
>50ng相当では無く、10ng相当を単独で泳動してWBした結果はあり、これでみると
>30kDaとほぼ同じ位置にバンドが出ました。1回目の反応の結果です。
だとすると、sample-bufferの還元剤や処置時間・温度などが12ugタンパクに対して十分でなかった可能性などを疑います。
いずれにしても、あれ！というときはコントロールを十分に取るのが近道だと思います。

(無題) 削除/引用
No.12456-4 - 2024/07/20 (土) 09:54:36 - おお
>[Re:2] qqさんは書きました :
> 12ugと50ngのタンパクを切断する酵素量や時間は、異なっているのでしょうか？
> 12ugを切断した後、50ng相当を泳動・ウェスタンすると、どうでしょうか？
>

やってみたらどうでしょうか？

12ugって相当のOverloadのように思えるので、何が起こってるかようわからん。サンプルのイオン強度が高くなると移動は遅れ気味になる。タンパク量が泳動のキャパ範囲だったら、バンドは下に太ってくる（そのため移動が速くなったようにもみえる）が、それ以上になると上にも太ってくるように見えるので、移動が遅くなっているようにも見えるだろうと思う。

もしかしたら一度４０kDaができて更に切断されるのかもしれんけど、１２ugのせている時点で仮にそうであっても説得力がない。

CBBで染めるにしても数百ngものっていれば十分でしょう。

(無題) 削除/引用
No.12456-3 - 2024/07/20 (土) 09:45:36 - ウェスタン
qqさん、ありがとうございます。

>12ugと50ngのタンパクを切断する酵素量や時間は、異なっているのでしょうか？
酵素量は1回目は12ugと50ngの比から同じように増加しました。酵素の値段が高いので節約の為に、2回目、3回目の時は酵素量をそこから25%減らしてしまいました。反応時間は毎回同で、反応させる温度はかなり厳格に37Cでウォーターバスで行いました。

>12ugを切断した後、50ng相当を泳動・ウェスタンすると、どうでしょうか？
（仰る通りに、これをサイドバイサイドでやっておけば良かったのですが、正確にそのようにはやっていませんでした）
50ng相当では無く、10ng相当を単独で泳動してWBした結果はあり、これでみると30kDaとほぼ同じ位置にバンドが出ました。1回目の反応の結果です。

(無題) 削除/引用
No.12456-2 - 2024/07/20 (土) 09:28:02 - qq
12ugと50ngのタンパクを切断する酵素量や時間は、異なっているのでしょうか？
12ugを切断した後、50ng相当を泳動・ウェスタンすると、どうでしょうか？

WBで、流すプロテインの量の違いで移動度が変わる？ 削除/引用
No.12456-1 - 2024/07/20 (土) 08:51:06 - ウェスタン
よろしくお願いします。

ウェスタンブロット(WB)を行っているのですが、ウェルに流したしたサンプルに含まれる目的タンパク質の量の違いで泳動度が多少変わり、ブロット後のバンドの位置が5-10kDa程度違って見えるという事は有り得るでしょうか？

研究しているタンパクはある酵素で切断されることが知られています。タンパク50ng程度と酵素を反応させた後にWBすると、切断後のタンパクが30kDa程度のところに見れます。30kDaというのは、一緒に流したマーカーから判断しています。

これをタンパク12ugと酵素と反応させて同じようにWBを行ったのですが、切断後のタンパクが35-40kDa程度のところに見られるました。3回行ったのですが、結果はいつも、少量で反応させた場合に見られる30kDaのところよりも大きい位置に見られます。サイズ差が5-10kDa程度とそれ程大きい差では無いですが、確かに少量での反応でみられる30kDaより高い位置に見えるのは間違い無いです。

使っているゲルはNuPAGE Bis-Tris 4-20%です。泳動バッファはMES Bufferです。当然これらの条件や、また泳動時間もいつも一緒です。
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