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みなさん回答ありがとうございます！ 削除/引用 No.12452-9 - 2024/07/21 (日) 21:37:39 - ぬっな nonameさん アドバイスありがとうございます！試薬料抑えても他でプラマイプラですね(´;ω;｀) LightCycler480を有料で借りる予定でしたが、他の研究室からbioradを無料で借りられることになりました(^▽^)/他のメーカー使って壊さないように気を付けます・・・(;´Д｀) Eさん １５万妥当ですか(;´Д｀)実習で先生がプロトコル作って試薬用意する３分クッキングみたいなリアルタイムPCRはやったことあるのですが、こんなに高価なものだったんですね(´・ω・｀)日常的にリアルタイムPCRやってる研究室はいったい・・・orz サーマルサイクラー不要ですか・・・先行論文でも抽出後に使ったり使わなかったりで、機会あるしやっとこくらいの気持ちでした笑 adg 高いですね！びっくりです。でも自分で予算計算してみて、良い経験にはなりました笑　たぶん次世代シークエンス外注で生データを頑張って解析のパターンの方が安いので、やるとしたらその線になる見込みです・・・

(無題) 削除/引用 No.12452-8 - 2024/07/21 (日) 13:27:51 - あかね オリゴはIDTにオーダー、断然安い。 初回限定のPromotion Codeを入力すれば更に激安に qPCRのSyberGreen系の試薬も、初回特価、サンプルリクエストで安く手に入れられる。

(無題) 削除/引用 No.12452-7 - 2024/07/21 (日) 11:02:19 - G25 > 既知量の(DNA調製時あるいは調製済DNAに)内部標準を投入するとか、 最近じゃ、spikeなんて言うんでしたかね

(無題) 削除/引用 No.12452-6 - 2024/07/21 (日) 09:12:36 - G25 リアルタイムPCRが世に出る前によくやられていたqPCRの方法に、competitive qPCRという方法があります。これなら通常のendpoint PCRとゲル電気泳動の道具立てでできます。バンド強度の定量が必要で、昔はRI使ったりしたもんだけど、今なら撮像装置で蛍光染色強度が簡単に測定できますし。 手間はかかりますけど安くあげたいなら 興味があれば、ネットでも(ちょっと古い)PCRの実験書でもやり方は調べられます。 ところで、定量は絶対定量したいのか相対定量でいいのか。 相対定量でも着目している6種細菌間の比率だけでいいのか、全腸内細菌に対する割合なのか。 それによっては、既知量の(DNA調製時あるいは調製済DNAに)内部標準を投入するとか、なんらかの方法で全細菌量で標準化する必要があります。その辺は考慮ありますか。

(無題) 削除/引用 No.12452-5 - 2024/07/21 (日) 08:27:42 - adg 気楽にポンポンqPCRかけてるけど、 ちゃんと費用計算すると、 実はけっこう高額だったりしますねw で、mRNAが動いていてもタンパクの結果は有意差がないことなんて日常茶飯事だし そーなると論文に使えないこともあるし いろいろ考えると結果的に費用対効果が悪い場合もあるきがします。

(無題) 削除/引用 No.12452-4 - 2024/07/20 (土) 04:42:14 - E > DNA抽出キットと普通のPCR(BIORAD-T100)は研究室に先輩の残機があるので予算からはじきました。 腸内細菌のqPCRはやったことがないのですが、BIORAD-T100ってサーマルサイクラーですよね。DNA抽出したあと必要ですかね？ま、予算からはじいたのであればいいと思いますけど。 > �@プレートについて、メーカーは違うのですがPCR用の8連チューブがたくさんあります。蓋がついていれば、プレート・シールセットの代用ができますか？ お持ちのチューブのメーカーにqPCRでも使えるか聞いてみましょう。あと、qPCR機器のブロックサイズが0.1mLチューブ用とか0.2mLチューブ用とかもあるかもしれないので注意してください。 できればその機器を持っているラボの人に細かい消耗品を借りる、あるいはおっしゃるように小分けで支払えればいいのですが。 > 今のところ15万はくだらないんですね… > 予算ってこんなものですか？話変わりますが、頼れる先生がいません。担当教員は相談に乗ってくれますが専門外です。でもどーーうしても腸内細菌叢の解析がしたいです。みなさんが頼りです…どうぞよろしくお願いします。 頑張ってほしいですが掲示板ですと詳細がわかりにくいのでコメントも難しいですね。初めてやる、試薬もチューブもないのであれば15万円もそれほど高いとも安いとも思わないくらいだと感じます。qPCRをやったことない先生なのですか？やはり機器を持っているところで一度流れを見せてもらえるといいと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.12452-3 - 2024/07/19 (金) 17:21:31 - noname SYBR系のマスターミックスならもっと安いメーカーがあるので、いろいろ探したらよいと思います。 プライマーはもちろん2本で1セットなので14本必要になります。もっと言うと精製グレードについて、望ましくはHPLCが良いので、もっとかかると思います。 陽性コントロールはこの検出系が成立していますよ、という証明のためにつけるので、あなたが検出しようとしている菌のgenomeとかを用いるのが良いのではないでしょうか。連絡をとれそうな先生がいるなら聞いてみたほうが確実です。非特異増幅が起きていないかを見るために、ネガコンも忘れずに。 あと、"定量"するのであれば、検量線もRUN毎に作らないといけないので、載せられるサンプル数はその分減るので、もうちょっと実験量が増えるかもしれません。 3反復の考え方はおおむねその認識でよいとおもいます。3ウェルすべて立ち上がらなくても失敗というわけではないので、都度判断になりますかねぇ。そのサンプルだけ再実験して確かめるという作業は出てきます。 グラフ等の色付けは機器によるので取説をみてください。 別のトピックで、LightCycler480を借りるといってませんでしたっけ？あれはRocheですよ。 qPCRの機器は、専用のtubeまたはplateでないと壊れるので、他機種のは流用できないので気を付けてください。

質問追加です 削除/引用 No.12452-2 - 2024/07/19 (金) 15:13:05 - ぬっな �D96ウェルプレート×2〜3枚で終わるくらいの実験規模ですが、よく論文で見かける「3回反復」というのは、同じ中身のウェルを3つ並べれば良いということですか？例えば検体�ｂPについて、乳酸菌を見るとして、乳酸菌のプライマーが入ったウェルを3個作れば3回反復になるのでしょうか？ それをリアルタイム定量で、同じような増え方をする3本の線が測定できれば成功ですか？それを同じ色に付けたりするのは後から設定するのでしょうか？最初から、これとこれとこのウェルは同じ物を増幅するからグラフの色を統一してね、という設定が最初からできるということですか？ すみません、素人の語彙では理解しにくいかもしれませんが・・・汲み取って頂けると助かります(´;ω;｀)

リアルタイムPCRの費用 削除/引用 No.12452-1 - 2024/07/19 (金) 15:06:15 - ぬっな リアルタイムPCRを初めて行う大学生です。卒業研究に使える予算が残り少ないのですが、どうしても腸内細菌の定量にリアルタイムPCRをしたいと思っています。 質問に番号を付けましたので、部分的にでもお答えいただけたら幸いです。 私の研究室ではこれまでリアルタイムPCRをやったことがありませんので、試薬や消耗品などなく、今回は小ロットですが購入を検討し、予算を組んでみました。 DNA抽出キットと普通のPCR(BIORAD-T100)は研究室に先輩の残機があるので予算からはじきました。それ以降のqPCRにかかる費用を計算してみました(相場がわかりません、よろしければ添削お願いします)。qPCR機器がbioradなので試薬消耗品等それに合わせました。 ・SYBRgreen系マスター試薬3万 iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix500回反応分 ・プレート50個・シール100枚で計8万 おそらく使うのはプレートとシール各3枚ほどなので、持ってる研究室から使った分だけ支払うというのができたらなと考えています �@プレートについて、メーカーは違うのですがPCR用の8連チューブがたくさんあります。蓋がついていれば、プレート・シールセットの代用ができますか？ ・プライマー作成2万 1菌種3000円？×5菌種 ＋ universalbacteriaプライマー ＋ 陽性コントロールで7種類のプライマーを購入することになると思うのですが、力尽きてしまい完全に理解が足りてません…笑。 �A20bp、200nmolで価格シュミレーションしたんですが、フォワードとリバースそれぞれ別で発注ですか？だとしたら倍になる… ・陽性コントロール？円 先行論文を読んでも陽性コントロールに何を使っているかわかりません… �B試薬はマスター試薬を使いますが、別ブランドを探せばキットに入っているものがありますか？ �C日本人で連絡取れそうな教授がおられるので、聞いてもいいんでしょうか？実験手順のpdfとかあったら見たいなあ…(´;ω;｀) 今のところ15万はくだらないんですね…16rS解析をまるっと外注する方が安いかもしれないです(´;ω;｀) 予算ってこんなものですか？話変わりますが、頼れる先生がいません。担当教員は相談に乗ってくれますが専門外です。でもどーーうしても腸内細菌叢の解析がしたいです。みなさんが頼りです…どうぞよろしくお願いします。

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