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(無題) 削除/引用 No.12451-6 - 2024/07/22 (月) 10:01:04 - qq wide-gelで短距離泳動して、ウェスタンするほうがいいんじゃない？

(無題) 削除/引用 No.12451-5 - 2024/07/21 (日) 02:00:07 - TS Slot blotというのは、いわゆるDot blotですよね。 以前少しやっていました。同じような問題にも直面しました。 まずPVDFはあまり推奨ではなく、ニトロセルロースがよいのではと思います。 PVDFは水を吸わないのに対して、ニトロセルロースであれば、水を透過するので、数時間あるいは一晩かけて、ブロットするとよいかと思います。 いずれにしてもSDSなどの界面活性剤の濃度が高いとタンパク質は吸着しにくいので、界面活性剤の濃度が薄いLysis bufferを使うか、あるいは私は、抽出後に一定濃度まで薄めてブロットしていました。ご自身のターゲットにしているたんぱく質の性質によって、どうできるかは変わってくるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12451-4 - 2024/07/20 (土) 07:47:47 - あの Pvdfにこだわる必要はありますか？　 タンパク吸着性能の高い９６ウェルプレートに吸着はどうですか？

(無題) 削除/引用 No.12451-3 - 2024/07/20 (土) 06:45:04 - R R あなたの調べようとしてるタンパク質は細胞からの抽出に界面活性剤が必要かどうかは確認されましたか。 界面活性剤がなくても、超音波処理とか、古典的な低張buffer中でのホモジナイズとか、（あまり勧めないけど昔からしばしば行われている）反復凍結融解など物理的方法でも細胞は壊れて、細胞質やオルガネラのかなりの種類の（もともと）可溶性のタンパク質は抽出できます。一方で膜タンパク質、核マトリクスタンパク質、クロマチン関連のタンパク質、細胞骨格系タンパク質（ポリメライズしている状態のものは難しいが可溶性モノマーの状態のものは抽出できることが多い）等は抽出が困難です。ただこれもケースバイケースで、個々のタンパク質の性質や抽出条件次第ではうまく抽出できることもありますので決して画一的な話ではありません。 いずれにせよ物理的方法で抽出可能かどうかは抽出処理して遠心し上清回収してImmunoblottingの流れで2日もあれば容易に確認できると思われます。 界面活性剤によっては透析などで除去することも可能ですし、SDSのようにタンパク質に強固に結合する系のものは透析による除去が難しいと言われてきましたが、最近は専用の除去kitもあるようです。ただ界面活性剤を除去することで再び不溶化するものも多いですし、界面活性剤の除去処理に伴う回収率についてはある程度ロスもあるでしょうから微量のタンパク質（or　低濃度）だと慎重な検討は必要かもしれませんし、その後で定量比較する実験のような場合は、抽出とassayの間に工程を入れることには特に注意が必要です。

(無題) 削除/引用 No.12451-2 - 2024/07/20 (土) 05:22:12 - おお >However, the proteins dissolved in RIPA buffer were inefficiently adsorbed onto the PVDF membrane. Therefore, we utilized a more suitable lysis buffer that contained tris-(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris), urea, thiourea, and (3-[(3-cholamidopropyl)-dimethyl-ammonio]-1-propane sulfonate) (CHAPS) [15]. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10144988/ Then, dilute test vaccine samples for human use obtained from vaccine producers or made in-house for scientific research purposes in 4M urea/TBS and mix well. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3169259/ 確かにRIPAでは吸着効率がわるく、Ureaなどを使うのがベターなようです。上記ではさらなる変性剤などを加えていますが、Urea 5M in TBSぐらいでいいのかなと思います。 あるいはマイルドなCHAPSとかのデタージェントも選択肢かもしれません。非変性状態のばあいTweenなど使われたりすることもあるようですが、Tweenの可溶化能力は非常に弱いです。

界面活性剤を使用せずに細胞からタンパク抽出したい 削除/引用 No.12451-1 - 2024/07/19 (金) 11:16:04 - pyon 細胞内タンパクの発現量をslot blotで評価する系を作りたいと思っています。 96wellで培養した接着細胞をRIPAバッファーで溶かしてslot blotしてみたのですが、やはり界面活性剤が入っているので、膜に吸着せずに漏れてしまうみたいです。 界面活性剤を使用せずに細胞からタンパクを抽出する方法、または界面活性剤を含むサンプルでPVDF膜に吸着させる方法があれば教えていただきたいです。 よろしくお願いします。

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