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(無題) 削除/引用 No.1245-7 - 2012/12/13 (木) 16:03:04 - TH aji KY おお様 親切なご回答有難うございました。 大腸菌内のキナーゼおよびリガーゼで結合されるのですね。 コロニーは5つ生えて、2つシークエンスを読んだところ、どちらとも入っていました。残り3つは読んでおりませんので分かりません。 有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.1245-6 - 2012/12/13 (木) 00:31:21 - おお ニックを大腸菌内で修正させるようですね。ライげーしょんすれば効率はよくなるような気がしますが、それはおそらくプロとコール作るときに考慮しているだろうと思えたりするので、結果としてライげーしょんしないほうがよかったのかもしれませんし、変わらなかったのかもしれません。 増幅した方の鎖が伸びきってなかったら、ライげーしょんで変なプロダクトが混じるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1245-5 - 2012/12/12 (水) 23:40:20 - KY quickchangeはニックの入ったプラスミドができるので、大腸菌内のリガーゼが修復してくれます。なので、トランスフェーメンション前にリガーゼ処理などいりません。 結局、できた５個のコロニーはほとんど変異が入っていたのでしょうか？ほとんど入っていたのであれば、変異の効率は十分によいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1245-4 - 2012/12/12 (水) 22:33:32 - aji 私も本当のところは知りませんが、ニック扱いで修復されてから複製されるんじゃないでしょうか。 でもDpnI処理の後、積極的にアニールさせるわけでもないし、プラスミドのサイズがきれいにアニールするとも思えないし、誰かが本当の仕組みを教えてくださると嬉しいです。

(無題) 削除/引用 No.1245-3 - 2012/12/12 (水) 22:22:42 - TH すみません。 PCRではないですね。 quickchangeの原理です。 5'末端はリン酸化されていないプライマーを用いています。 効率が悪いというのは適切な表現ではないですね。すみません。 mutant strandを12サイクルで合成した後、そのまま大腸菌にトランスフェクションすると、コロニーが5つしかなかったので、効率が悪いと適当に申し上げました。合成された変異体のDNA量が少なければ効率はよいかもしれませんが、濃度測定はしておりませんのでわかりません。アガロース電気泳動をするとproductはみえませんのでおそらく濃度は低いことになります。と考えると意外に効率はよいのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1245-2 - 2012/12/12 (水) 21:45:58 - aji どのようなプライマーを使ったか示して頂かないとキナーゼやリガーゼが必要かどうかを判断することは出来ません。 想像するにQuickChangeの原理で行ったのではないでしょうか？ それだとPCRではないですよね。 効率が悪いというのも何と比較しているのでしょうか。形質転換に使用したDNA量を把握した上で悪いと判断しているのでしょうか。

部位特異的変異導入について 削除/引用 No.1245-1 - 2012/12/12 (水) 21:26:52 - TH 部位特異的導入を入れる際、 変異の入ったプライマーでPCR反応を行ったあと、 DpnIでテンプレートの消化を行い、 その後、ポリヌクレオチドキナーゼとリガーゼを 使うべきですか?使用しなくてもコンストラクトができたのですが、 効率が悪かったのでお聞きしました。 教えてください。

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