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(無題) 削除/引用 No.12447-4 - 2024/07/17 (水) 16:59:29 - NEB 制限酵素部位BかCかは再生しているんですか？

(無題) 削除/引用 No.12447-3 - 2024/07/17 (水) 14:04:56 - G25 （プロモータ-B）+（C-ベクター）でつながっているということみたいですが、 ABCはそれぞれどの制限酵素でしょうか。 >3断片でのライゲーションが2断片と比較して難しいのか， 難しいでしょうよ。 >3断片の比率(モル比は1:2:10)が悪いのか， モル比をいじっても歩留まりが変わるだけで、出来なかったものがいきなりりできるようになるというものじゃないでしょう。 >原因が分からず2週間ほど停滞しているのですが， それだけの時間があればストラテジーを変えてやり直したほうが早かったかも。in-fusionとか、一旦、２ピースでコンストラクトして、次に1ピースはめ込むとか。

(無題) 削除/引用 No.12447-2 - 2024/07/17 (水) 13:43:57 - おお 5'UTRの酵素の酵素処理がうまくいってないのかなぁと思います。或はプロモーター側のBの部分。 こういうのはプランBなんかも用意しておく方が泥沼に入り込むのを回避しやすく、 例えば、プロモーターのPCRフラグメントにUTRの5‘の配列がつくようにTagつきプライマーで増幅して、Overlap extension　PCRするとかもてだと思います。 https://en.wikipedia.org/wiki/Overlap_extension_polymerase_chain_reaction

3断片のライゲーションのコツ 削除/引用 No.12447-1 - 2024/07/17 (水) 09:55:46 - ま いつもお世話になっております。 5000bpのベクターに2000bpのプロモーターと170bpの5'UTRを挿入して， ベクター-制限酵素A-プロモーター-制限酵素B-5'UTR-制限酵素C-ベクター の形になるプラスミドの作製を試みています。 しかし，Colony PCRや抽出後のPCRの結果を見ると，どうやら5'UTRが挿入されていないことが多く，困っています。 3断片でのライゲーションが2断片と比較して難しいのか，3断片の比率(モル比は1:2:10)が悪いのか，原因が分からず2週間ほど停滞しているのですが，なにかコツなどありましたらご教授頂きたいです。

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