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(無題) 削除/引用 No.12445-13 - 2024/07/20 (土) 01:45:24 - 橘 ミツバチの腸内から「定量で細菌を採集する」方法は確立されているのでしょうか？ 海洋細菌なら「海水数L」をフィルターで濾過することができますが、ミツバチの腸内細菌で上記「海水数L」に相当するものは何でしょうか。 解剖して消化管を取り出して湿重量を測定するか、それをエタノール固定してから乾燥させて乾燥重量を測定するとかでしょうか。 何らかの処理の有無での差を見たいのなら、各処理X個体から消化管を取り出して分析し、個体数を使用するのが楽かもしれません。 その辺りも事前に検討が必要だと思います。 そこは解決済みならスルーして下さい。

(無題) 削除/引用 No.12445-12 - 2024/07/19 (金) 21:34:11 - G25 昆虫の腸内細菌叢の16S メタゲノム解析なら、そして着目している6種細菌が細菌叢の中でレアなものでなければ、 低品質リードをフィルターした有効リード数で1万もあれば十分でしょう。

(無題) 削除/引用 No.12445-11 - 2024/07/19 (金) 19:41:04 - Liar > 詳細をお聞きしたいのですが、今の時代最終的には配列を読む、というのは、培養でやってみても同定に至らない可能性が高いということでしょうか？ > > それとも、昔は属を同定するだけで意味があったけど、今は遺伝子解析で種レベルまで明らかになっているため、種まで同定しないとデータとして意味がないという理解で合ってますか？ 光岡知足先生のころと違って、分子系統学的解析が発展して、元々分類されていた属から独立して新属になったり、新属・新菌種が登録されたりと、これまでの形態学的、生化学的性状の分類法では限界がありますので、誤る可能性はあります。 データの信頼性が高いかどうか（担保できるか）、気になるところです。

(無題) 削除/引用 No.12445-10 - 2024/07/19 (金) 19:25:30 - Liar >[Re:7] G25さんは書きました : > いちばん現実的で実効性が高いのは16S rRNAメタゲノム解析でしょう。 > Qiime2等によるデータ解析を自前でやることにして、シークエンス生データ取得だけ外注するならば、1検体1万円くらいからあるんじゃないかしら。 5万リード/検体、相乗り解析とかすれば、確かにコストも抑えられて、現実的で実効性が高いかもしれないですね。

(無題) 削除/引用 No.12445-9 - 2024/07/19 (金) 18:56:39 - G25 ただし、TaqMan probeがこれまた高価だけどね。 1 probe 7万円くらい？　6種で42万円 メタゲノム外注のほうが安上がり。

(無題) 削除/引用 No.12445-8 - 2024/07/19 (金) 18:48:07 - G25 qPCRでやるならPCRプライマーはユニバーサルにして種特異的なTaqMan probeを使うのがいいと思う。PCRプライマーの配列の違いで種を見分けるのはそう簡単ではない（多少の配列の違いがあってもPCRがかかってしまうことが多い）けど、TaqMan probeなら特異性の切れ味が良い。種ごとに異なるプライマーだと、それぞれ増幅効率が違ってバイアルがかかる可能性があるけど、全種、同一のPCRプライマーならその心配が少ない。

(無題) 削除/引用 No.12445-7 - 2024/07/19 (金) 18:26:38 - G25 シークエンスしようとかユニバーサルプライマーで細菌種網羅的に16S rRNAを増幅しようとかいうんじゃないんですよね？ 標的細菌種（6種）に特異的なプライマーでqPCRして、特定の細菌種の絶対的または相対的な存在量を求めたいということですよね。 そういうプライマーセットをデザインするのも容易ではないし、うまく動くqPCRの系を確立するのも相当苦労しそう（内部標準とか標準化とか）。 >�C予算の面で試薬や機器が使えないかもしれないのですが、他に腸内細菌を定量する方法をご存じであればご教示ください…(´;ω;｀)処置をする前後でサンプリングするので、時間軸的に相対変化が分かれば手法は何でもいいです いちばん現実的で実効性が高いのは16S rRNAメタゲノム解析でしょう。 Qiime2等によるデータ解析を自前でやることにして、シークエンス生データ取得だけ外注するならば、1検体1万円くらいからあるんじゃないかしら。 qPCRでまともなデータが出せるまで（しかもpromissingでない）試行錯誤するほうが労力も含めコストがかかると思う。

(無題) 削除/引用 No.12445-6 - 2024/07/19 (金) 15:30:26 - ぬっな Liarさん 詳細をお聞きしたいのですが、今の時代最終的には配列を読む、というのは、培養でやってみても同定に至らない可能性が高いということでしょうか？ それとも、昔は属を同定するだけで意味があったけど、今は遺伝子解析で種レベルまで明らかになっているため、種まで同定しないとデータとして意味がないという理解で合ってますか？

みなさん回答ありがとうございます。 削除/引用 No.12445-5 - 2024/07/19 (金) 15:27:14 - ぬっな ご回答いただきありがとうございます。 もし先行論文から引用したプライマーで増えなかったら、配列を読む作業が必要になるんですね…そこまでする予算が無いです(;´Д｀) 培地で属レベルまで同定したら、この属ってことはこの種かもってことは既知の知識から言えます、たぶん！標的動物の腸内細菌叢が偶然非常に多様性が低くて、せいぜい7種程度で、属の被りもほとんどないので、出来るかもしれません…！ ただそこまで研究室の専門範囲を超える感じだと、担当教授にウ(゜゜)と思われるかもしれませんが・・・笑 あとたぶん他の研究室の力を借りないと出来ないので、大学のシステム的な是々非々が壁ですかね(;´Д｀)また、目視で確認だと、有意な差が出てくれるか…技術的な不安もあります。 なんにせよみなさん回答ありがとうございました！培養も考えてみます。

(無題) 削除/引用 No.12445-4 - 2024/07/18 (木) 09:52:19 - Liar > �A菌株に関係なく、菌種が合っていれば海外論文で使用しているプライマー配列をパクってもちゃんと増えるのですか？ 増えないことも（稀に）ありますし、データーベースに配列が載っていない未発表（未記載・未発見）の菌種が増える可能性がないとも言い切れません。 ただ、よく用いられているプライマーセットを探して実施するのがよいとは言えます。 一般細菌で標準化されたプライマーセットはなかなかないですし。

(無題) 削除/引用 No.12445-3 - 2024/07/17 (水) 08:54:04 - Liar > �C予算の面で試薬や機器が使えないかもしれないのですが、他に腸内細菌を定量する方法をご存じであればご教示ください…(´;ω;｀)処置をする前後でサンプリングするので、時間軸的に相対変化が分かれば手法は何でもいいです 古典的な方法で属レベルまでですが、複数種類の培地を使い嫌気培養・好気培養をして細菌数をカウントする方法はあります。 ただ、同定にはそれなりの経験が必要です。 今の時代、最終的にはシーケンス解析やMALDI-TOF MSで同定をすることになるでしょうが...

(無題) 削除/引用 No.12445-2 - 2024/07/16 (火) 05:37:30 - おお >[Re:1] ぬっなさんは書きました : > 質問 > �@プライマーはr16S遺伝子を増幅するものを使用することについて、定量したい菌種が6つあるのですが、それぞれについてのr16s遺伝子プライマーは異なる。universal bacteriaプライマーは次世代シーケンスなどで用いる物という理解はあっていますか？ 大体それであってます。お考えのプライマーセットが実際にSequencingで使われているのかなどは以下のURLが参考になるかと思います。 https://help.ezbiocloud.net/16s-rrna-and-16s-rrna-gene/ いろいろな組み合わせがあるようですが、大体V4あたりをPCRするのがポピュラーなようです。 またここのバクテリアの検出においてもユニバーサルプライマーは全体のバクテリアのポピュレーションの指標にもなるかと思います。Internal controlみたいな扱いです。 > �A菌株に関係なく、菌種が合っていれば海外論文で使用しているプライマー配列をパクってもちゃんと増えるのですか？ 論文で公表されていたならパクるというよりは、参照にするとか言うほうがいいと思いますが、、、 基本それでいいと思います。複数の論文をなるべくあったって同一のプライマーを使っているかなど一応見たほうがいいかもしれません。これってすでに標準化されているのでしょうかというのもちょっと気になりますが、そのへんは詳しい方に譲ります。 > �B各細菌について1ウェル使うのですか？96穴なのですが、その一つ一つの穴に、抽出dnaと細菌1種類のプライマーを入れて、陽・陰性controlを合わせて、6菌種＋2controlで8ウェル使うということであっていますか？ qPCRは場合によってば飛値が出るという話はきくので一つのサンプルにつき複数のWell使ったらどうでしょうか？N=3とか > �C予算の面で試薬や機器が使えないかもしれないのですが、他に腸内細菌を定量する方法をご存じであればご教示ください…(´;ω;｀)処置をする前後でサンプリングするので、時間軸的に相対変化が分かれば手法は何でもいいです > 昔は培養用プレートで増殖させてとかしていたと聞きますが、それでも結局は配列を読むことになるかな、、、

リアルタイムPCR初心者、腸内細菌を定量したい 削除/引用 No.12445-1 - 2024/07/15 (月) 22:17:29 - ぬっな 大学生です。卒論でミツバチの腸内細菌叢を定量分析したいですが、所属研究室にそのノウハウや物資が無く、プロトコル作成に手間取っています。機械は、Lightcycler480を借りる予定です。 質問 �@プライマーはr16S遺伝子を増幅するものを使用することについて、定量したい菌種が6つあるのですが、それぞれについてのr16s遺伝子プライマーは異なる。universal bacteriaプライマーは次世代シーケンスなどで用いる物という理解はあっていますか？ �A菌株に関係なく、菌種が合っていれば海外論文で使用しているプライマー配列をパクってもちゃんと増えるのですか？ �B各細菌について1ウェル使うのですか？96穴なのですが、その一つ一つの穴に、抽出dnaと細菌1種類のプライマーを入れて、陽・陰性controlを合わせて、6菌種＋2controlで8ウェル使うということであっていますか？ �C予算の面で試薬や機器が使えないかもしれないのですが、他に腸内細菌を定量する方法をご存じであればご教示ください…(´;ω;｀)処置をする前後でサンプリングするので、時間軸的に相対変化が分かれば手法は何でもいいです よろしくお願いします。

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