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(無題) 削除/引用 No.12443-10 - 2024/07/17 (水) 09:03:28 - FEN おおさん、ありがとうございます。 endosome の分離も plasma membrane の分離もちょっと目的を達成できなそうです。 今は、細胞表面のタンパクをビオチン化してアビジンビーズを使うやり方を検討中です。やっやことありませんし、こういうのはあまり得意な分野ではないので、できるのか自信が無いんですが。しかもそれなりの費用が掛かりそうですし。 また相談させて頂けると心強いです。 どうもありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12443-9 - 2024/07/17 (水) 01:35:16 - おお membrane protein extraction kit (BioVision) のProtocol bookletをみました。 最初にTotal membrane（containing proteins from both plasma membrane and cellular organelle membraneと書いてある）、さらにPlasma Membraneを精製するといった手順になっているようです。 どのような方法論なのかよくわかりませんので精度はわかりません。表面電荷だろうか、、、 またTotal membraneの回収の遠心力がそれほど高くないので、回収率や取れてくるものの偏りなんかもちょっと気になります（バッファーで工夫があるのかもしれませんが）。 まあコントロールとの比較ということなら実験として成り立つでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.12443-8 - 2024/07/16 (火) 23:24:22 - おお ビオチン化は組織でどれだけうまくいくのかは個人的には未知数です。 細胞（表面の）膜を回収するとか、エンドソームと分けるとかについては昔からやられている方法は密度勾配遠心で超遠心で分ける方法は見たことがあります。 ぐぐると、以下のようなものが見つかりました。 inventbiotech.com/products/minute-endosome-isolation-and-cell-fractionation-kit?_pos=1&_sid=883f65c68&_ss=r inventbiotech.com/pages/a-norval-technology-for-isolation-of-endosomes www.genetex.com/Product/Detail/Trident-Endosome-Isolation-Kit/GTX35192 キットの出来具合についてはわかりません。

(無題) 削除/引用 No.12443-7 - 2024/07/16 (火) 13:17:43 - FEN おおさん、ありがとうございます。 これだと分画キットを使っても難しいでしょうか？？ あるいは、細胞表面のタンパク質をビオチン化して検出する方法が論文にありますが、これは培養細胞だけでなく、組織標本でもできるものでしょか。

(無題) 削除/引用 No.12443-6 - 2024/07/16 (火) 06:39:45 - おお endocytosisでEndosomeになっても膜フラクションとして回収されますので。

(無題) 削除/引用 No.12443-5 - 2024/07/16 (火) 06:36:15 - おお >膜タンパクを細胞質画分を分けてendocytosisによる細胞質への移行レベルを調べようと思っておりますので、 Endosomeと細胞膜（表面）を分けようとするならばちょっとそう簡単には行きませんけど、、、

(無題) 削除/引用 No.12443-4 - 2024/07/14 (日) 16:06:24 - FEN いさん、ご返信ありがとうございます。 BioVision の Membraine extraction kit が Abcam から販売されていて、引用数が非常に多いので自分の目的にかなっているかを調べてみようと思いました。すごく助かります。ありがとうございます。 おおさん、アドバイスありがとうございます。 TRITON-X114を使う方法、簡単そうなので調べてみようと思います。 実は、地震で超遠心機が壊れてしまい、100000×g などの条件で分画できない状況なんです。膜タンパクを細胞質画分を分けてendocytosisによる細胞質への移行レベルを調べようと思っておりますので、トータルでなく分画できたらと考えております。 すごく参考になりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12443-3 - 2024/07/14 (日) 03:27:56 - おお トータルでWBするのは視野にないのでしょうか。 膜タンパクの抽出は方法論を調べると意外とシンプルです。大体2通りに分けられると思います。 低張のバッファーでホモジナイズして数千gでデブリなど除き、100000gで膜を回収する。 この方法はミエリンなど大量に含む神経組織ではミエリンが混じっていることを念頭に置いた方がいいです。PBSでホモジナイズして細胞を回収するというのもてかもしれません。 TRITON-X114を使う方法。まずTRITONX-114を含むバッファーでLysateを作り、軽い遠心でデブリを除き、Lysateを30度ぐらいに温めるというかTRITONーX114は水槽と分離して疏水性の高い膜タンパクはTRITONーX114の相に移行します。その温度で遠心して底に溜まったフラクションを回収すると言った方法です。

(無題) 削除/引用 No.12443-2 - 2024/07/13 (土) 22:23:19 - い だいぶ前ですがmembrane protein extraction kit (BioVision)というのを使いました。培養細胞だったので組織ではどうかわかりませんが、複数のマーカーなどで確認して細胞についてはかなりいい感じで分画できてました。 どこのもたいてい同じような論文を元にして同じようなプロトコルでやってると思うので大差ないように思います。ただもともと細胞膜タンパク質は量が相対的に少ないので収量をある程度得ようと思うと相応の組織or細胞試料が必要になります。特に培養細胞とかから細胞膜タンパク質画分を分離精製するときは結構な量の細胞が必要になります。あまり少ないと収率も低下して、取れないこともあります。組織ならば必要量の心配はあまりないと思いますが、それでも小さい組織では一応注意した方がいいので、どのくらいの組織量からどのくらいの量の細胞膜タンパク質が取れるみたいなのは書いてあると思うのでよくチェックして、分画後の必要量も勘案して実験計画を立てましょう。

膜タンパク抽出キット 削除/引用 No.12443-1 - 2024/07/13 (土) 11:25:10 - FEN いつもこの掲示板には助けられており、本当にありがとうございます。 一つ、お聞きしたいことがあり、どのたかご経験や噂などをご存知でしたら教えて頂けると助かります。 現在、マウス海馬の膜タンパク質を抽出して、ウエスタンブロッティングにてある目的のタンパク質を検出したいと考えています。ネットでplasma membrane extraction kit が多く販売されているのを知りましたが、どこのメーカやキットが良いのかなどの情報をお持ちでしたら教えて頂けると助かります。 よろしくお願いいたします。

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