BioTechnicalフォーラム [細胞でタンパクを過発現させたい時のvectorの設計について]

細胞でタンパクを過発現させたい時のvectorの設計について

No.12441-TOPIC - 2024/07/12 (金) 11:33:10 - ようこ

ウシのSYT14というタンパクを培養細胞に過発現させたいと思っています。
PromegaのpCMVTnT vectorにSYT14 cDNAの配列を入れたいのですが、cDNA全長が10800 bpほどあり、クローニングができません。
cDNAの配列のうち、CDS(coding sequence)は1600 bpほどなのでクローニングができそうです。
アミノ酸をコードするCDSのみvectorに挿入すれば、トランスフェクション後に細胞内でSYT14が作られるように思うのですが、CDSのみを挿入したoverexpression vectorを使ったという過去の例が見つかりません。
この場合、CDSのみではタンパクの発現は正常に行われないのでしょうか？教えていただけるとありがたいです。よろしくお願いいたします。
　

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No.12441-5 - 2024/07/13 (土) 10:05:48 - おお

確かにあまり慣れてない様にみえますが。ちょっと嫌なのはCDSだけでいいよといって、そこをクローニングしたものの上司に報告したら、いやこれでは使えないと言われたりする場合責任が取れないからです。質問でcDNAのUTRを含んだ発現ベクターしか見たことがないと言うことからも（多分質問者の研究環境で）、UTRにもしかしたらこだわりがある研究をやってないかとも思えたりもします。あとCDSがわかっているのだからUTRについても知識があるように思えますし。そういうの習ったからこの言葉使っているんですよね。

一番直接的なのはぜひ、研究全体を把握している所属する研究室のかたに相談することです。

ほんとに発現だけの場合、シンプルにあとUTRはなくても良いと書いてしまいましたが、翻訳開始Metは周りの配列は翻訳開始に影響を与えますなのでMetの上流少なくとも１０ベースぐらいは必要なものと考えてください。翻訳開始のためにターゲットの遺伝子のMet上流よりもコザック配列としてコンセンサスを抽出した配列がよく使われたりもします。コザック配列、翻訳開始でぐぐるとどんな設計にするかとか見つかると思います。InvitrogenやPromegaとかが解説のページを設けていたかと思います。ヒトやマウスの遺伝子の発現ベクターでは余分なUTRを除いたものがほとんどです。

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No.12441-4 - 2024/07/13 (土) 02:22:52 - あ

おおさん

相手がほとんど素人であることは明らかです。
もっとシンプルに行きましょうよ。
この場合、例外の情報を与えることは混乱と不安を招くだけと思います。

相手がどんな情報を求めているのか、理解することは大事です。

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No.12441-3 - 2024/07/12 (金) 15:38:11 - おお

普通CDSだけ入れます。まあ例外としては昔なら特に制限酵素が使える所を選ぶと言う事もあっただろうけど。

UTR の機能を加味しないといけないなら別ですけど。

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No.12441-2 - 2024/07/12 (金) 12:48:05 - TS

発現ベクターでは普通はCDSのみと思いますよ。