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(無題) 削除/引用 No.12432-11 - 2024/07/09 (火) 10:39:31 - toto プラスミドはとれるかもしれませんが、とれてもその配列確認が必要になるので、入手しなおしたほうがいいと思いますよ。addgeneにとりあえず連絡して、以前購入したものをなくしたのでもう一度送ってくれないかと頼んでみたらどうでしょうか。やったことはないですが、一応、非営利団体なので。 ダメなら、その作成者に直接依頼してみる手もあります。以前、addgeneにあげたプラスミドについて費用がかかるので送ってくれないかと私に直接メールが来たことがあり、送ったことがありました。

(無題) 削除/引用 No.12432-10 - 2024/07/09 (火) 06:45:18 - Bcc コロニーをごっそり拾って。

(無題) 削除/引用 No.12432-9 - 2024/07/09 (火) 06:43:42 - Bcc よくは知らないのですが、crudeですが、下記のboiling methodでプラスミドを抽出したのちエタ沈したものを、DH5aに形質転換できないですかね？ This experiment is called “Boiling method”. In this experiment, STET solution (100 mM sodium chloride, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 5% Triton-X or Tween 20) is added to E. coli pellet and suspended well. And then, the sample is heated to 100°C for 1 minute and centrifuged. After centrifugation, plasmid DNA is recovered in the solution, whereas insoluble heat-denatured proteins make debris as pellet fraction. After separating plasmid DNA from debris and precipitating plasmid DNA by adding alcohol, the final plasmid sample is capable for the next experiment.

(無題) 削除/引用 No.12432-8 - 2024/07/09 (火) 06:01:43 - おお recA欠損株は似た配列があったときその領域にリコンビネーションが起こるのを防ぐためです。 recAがあるとプラスミド構築でもこのようなことが起こることがあるので配列によっては目的のプラスミドが得られなくなります。どんなプラスミドを作るときににも起こるかというとそうでもないと思いますが、大抵のConstruction用の大腸菌にはrecA欠損株が使われます。 endAはヌクレアーゼでプラスミド精製中の分解を防ぐために欠損させていることが多いです。ただ欠損してなくても収量は落ちるもののインタクトなプラスミドは取れています。 上記の理由からそのようなB株の大腸菌でプラスミドを増やすことは普通やりませんし、もし構築を考えているのならそれに加えK株ほど高いCompetencyのコンピテントを作ることも難しいので普通はやりません（やる人はいないとまでは言いません）。 ただし、蛋白合成用のB株もプラスミドが維持されているから蛋白合成が可能なわけだし、抗生物質を使っている限りそのプラスミドは維持されているわけですから、そこからプラスミドを抽出するのは可能です。 ちなみにGenoTypeでrecA1やrecA13と書いているのはrecAに変異があり機能しないということです。endAとかいているのもendAが機能しないという意味です。このような記載がBL21にはないのでこれらの遺伝子は機能しているということです。

(無題) 削除/引用 No.12432-7 - 2024/07/09 (火) 04:58:42 - addgene 再度購入に関しては、それなりにお金がかかるため、どうにかそれ以外の方法で、考えたいところです。

(無題) 削除/引用 No.12432-6 - 2024/07/09 (火) 04:56:26 - addgene おおさん、あのさん、ありがとうございます。 recAやendAは欠損してないんですね、すみません私の見間違いだったようです。 ではchampion21ではDH5aやXL-10gold同様、形質転換してプラスミド増幅にも使えると言うことでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12432-5 - 2024/07/09 (火) 03:24:41 - おお >[Re:4] あのさんは書きました : > またaddgeneから購入できないのですか？ へたにシーケンスまでやることになるならそのほうが安上がりかもしれませんね。そこまで書こうかとちょっと思った。

(無題) 削除/引用 No.12432-4 - 2024/07/09 (火) 03:12:49 - あの またaddgeneから購入できないのですか？

(無題) 削除/引用 No.12432-3 - 2024/07/09 (火) 01:37:53 - おお recAは欠損してませんが、、、endAも欠損してません。 MC1061/P3というK株のコンピテントがありますが、これもendAやrecAをいじってはいません。プラスミド構築に不利なところもありますが、使われてきたという実績はあります。 総じてプラスミドは取れると思います。Champion21ストックから念の為数個のクローンから個別にプラスミドを精製して気になるならシーケンスしてみてください。 しかし、-30度で保存できるのでしょうか。。。もし大腸菌が増えないのなら、保存しているストックをそのままミニプレップする手もあります。

(無題) 削除/引用 No.12432-2 - 2024/07/08 (月) 22:33:28 - addgene トピ主です。 やはりBL21同様、recA欠損株なため、プラスミド構築、維持には不適切、と書かれてありました。 Addgeneのプラスミド溶液を紛失した以上、ここは形質転換済みのChampion21のストック菌株から増やさずに、いきなりプラスミド抽出し、どうにかそれを使ってDH5aに形質転換してシングルコロニーをいくつか拾うというのが最善策でしょうか？

Champion21からプラスミドを抽出してもいいですか？ 削除/引用 No.12432-1 - 2024/07/08 (月) 19:45:04 - addgene お世話になります。 Addgeneから大腸菌でのタンパク質発現用のプラスミドを二年ほど前に購入し、いきなりChampion21に形質転換後、タンパク質の精製を問題なく行いました。 この度再びそのタンパク質を調製するためにaddgeneのプラスミドを保管ボックスで探すと紛失していました。 そこで-30度の形質転換し終えたシングルコロニー由来のChampion21がいるのを見つけました。 ここからシングルコロニーを拾ってタンパク質の発現精製をしつつ、plasmid DNAもとって保存出来ないかと考えています。 ただ、BL21はプラスミド増幅に向かないとか、正しく複製しないとか？を昔先輩から言われた記憶があります。全ては私がAddgeneから購入してすぐにDH5aなどに形質転換してプラスミドを増やせばよかったのですが・・ 私の質問は、 -30度のChampion21からプラスミドDNAを抽出してもいいでしょうか？抽出できたとしてそれは正しいDNA配列だと考えていいのでしょうか？ よろしくお願いします。

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