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(無題) 削除/引用 No.12429-5 - 2024/07/07 (日) 08:17:22 - G25 多分、根拠があるわけでない流言の類でしょう。 エラー率を調査して報告している論文でも分母が塩基長あたり/サイクルあたりのようになっているのもあったりします。少なくともプラクティカルにはサイクルあたりのエラー率が一定と考えて差し支えないということでしょう。 あるとしたら、条件によっては反応の後半、基質dNTPが消費されて、ヌクレオチド種のバランスが崩れたりKmの高いヌクレオチドの濃度が下がったりするためかも。あえてそういう状態にしてランダム変異を誘発するerror-prone PCRにように。 それとサイクル過剰で誘発される塩基置換変異ではない問題はいろいろあります。 産物濃度が高くなってくると鋳型-プライマーの会合より、鋳型-鋳型のコリジョンが高くなって、モザイク産物や重合体が生じるなど。

(無題) 削除/引用 No.12429-4 - 2024/07/06 (土) 10:53:37 - おお データーとかは時間があれば探してみますけど、確かにへたると変異が入りやすいかもしれないという直感的なものはなきにしもあらずですが、１６CyclesのPCRでもそれなりに変異が入ります。へたる以前にもともと変異が入りやすい酵素と言えるでしょう。 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0378111992902995?via%3Dihub また、 https://www.neb-online.de/wp-content/uploads/2015/04/NEB_Polymerase_Fidelity_Article_2012.pdf こちらでは１６サイクルと２５サイクルのデーターを示してます。１６サイクルでも２５サイクルでもほぼ一緒の変異率だったりしますが、１６サイクルはLacZ活性、２５サイクルでは実際のシーケンスなのでその違いが出ているものと思われます。 上記の結果で考えるとTaqで３kbに１つ程度の変異が入るわけですから、１kbのフラグメントをプラスミドに入れたとして３個に１個は変異が入っていることになりますね。 経験的にはTaqはもう少し変異が入っているような気がしないでもないですが、、、

(無題) 削除/引用 No.12429-3 - 2024/07/06 (土) 10:24:41 - 774R 追記すると、エラーを減らすために鋳型DNAを多めに加えてサイクル数を減らすことが行われます。鋳型0.1ugでも理論上10サイクルで1000倍の100ugとなり、実際はもっと早くプラトーになっていると思われます。 サイクルの後半では「複製」が行われず「エラー」も増えないということにまります。

(無題) 削除/引用 No.12429-2 - 2024/07/06 (土) 10:17:53 - 774R へたるかどうかに関係なく、複製回数に依存するので、サイクル数が増えるとエラー率が上がるのは当然です。 へたったためにエラー率が上がるというなら、エラー率が増幅量と比例せず、曲線的に急峻になるはずですが、そんな実験をしてる人はみたことない。 ※ここでサイクル数ではなく、増幅量と明記したのは、サイクルが増えるにしたがってPCRの効率が悪くなるので、横軸にサイクル数をとると見かけ上、後半に行くにしたがって鈍ってしまうから。

DNAポリメラーゼ 削除/引用 No.12429-1 - 2024/07/06 (土) 09:58:55 - Pol ふと思ったことですが、PCRの際にTaqを使うと、"サイクル数の後半ではTaqがヘタリ"、そのためエラーが入ると先輩から聞きました。 しかしそれを示すデータというのはありますか？ たとえば横軸をcycle数、縦軸をエラーを持つPCR産物の%みたいなグラフがあると直感的に理解しやすいです。というのも、もし後半でへたってエラーが生むのであれば、それでもエラーを持つ%PCR産物は無視でっきるほどの％だと思うので、そんなに気にするほどでもないのではと思ってます。 一方、Taqはサイクル数の後半かに依らず、初めからエラーを入れるということであれば、エラーを持つ%PCR産物は無視出来ないのかなと思っています。

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