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(無題) 削除/引用 No.12423-13 - 2024/07/04 (木) 10:27:20 - あの そういえば、BSAにコンジュゲートした小分子を免疫源にして作成した抗体が以前はあったので、御注意を。 最近、開発、販売されているポリクロや、モノクロなら、大丈夫だと思うけど、、、

(無題) 削除/引用 No.12423-12 - 2024/07/04 (木) 10:21:58 - NOD ELISAすればいいんじゃない？と思いましたが、SDS-PAGEが必要な理由があるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12423-11 - 2024/07/04 (木) 08:34:16 - たこ 参考になるかわかりませんが PBS wash x2 Serum free medium wash x1 Overnight incubation with serum free medium Medium change and 48~72 h incubation 私はDMEM/F12とRPMI1640使ってこれでよくやっていました。 見たいもののサイズが全然違うからBSAは問題になったことが無いだけかもしれませんが。 ただ、先に言及されているようにBSA入りのAdvanced DMEM/F12みたいな培地だとまずいでしょうけど。

Blocking 削除/引用 No.12423-10 - 2024/07/04 (木) 07:58:41 - あかね WBのBlocking、抗体希釈液にFBSを2%加える。

(無題) 削除/引用 No.12423-9 - 2024/07/04 (木) 07:11:56 - おお >�BAlbuSorb,Promaxなどのウシ血清アルブミン除去キットを試す きっとよりCibacron Blue 3Gというゲルを買ったほうがやすいと思うけどどうだろう。 https://www.gbiosciences.com/Protein-Research/Purification-Chromatography/Affinity-Purification-Resins/Immobilized_Cibacron_Blue_3G

(無題) 削除/引用 No.12423-8 - 2024/07/04 (木) 06:56:25 - おお 無血清にする前の培養（または処理など）を２％ぐらいのFBSでできるなら同じ操作でも理論的には５分の１に減らせますよね。 上清を濃縮していますが、WBなら濃縮しなくても見れなくないのではという気もしますが、、、

(無題) 削除/引用 No.12423-7 - 2024/07/04 (木) 06:22:17 - あの 自分も次を考えます �@洗いの回数を増やす �AELISAで検出 ただし洗いは、PBSだけではなく、FBS無添加培養液を使った方が良いかもしれません。 それからElisaは、サンプルを段階希釈して、スタンダードカーブとパラレルになることを確認する。 同様の悩みを持つ人が多いと思います。そのため、ぜひ、上手くいったら、報告してください。

(無題) 削除/引用 No.12423-6 - 2024/07/04 (木) 05:50:13 - おお 抗体がIP可能なものならIPしてみるのも手だけど、IgGも被ってくるかな、、、Light chainスペシフィックとか変性IgGには反応しないとか工夫がいるかも、あるいは２種の動物の違う抗体を持っているならやりやすいけど。

(無題) 削除/引用 No.12423-5 - 2024/07/04 (木) 05:45:58 - おお https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-gel-electrophoresis/protein-gels/specialized-protein-gels/novex-ief-gels.html SDSPAGEではなくIEFで分離するとか、、、あまり現実的ではないか、、、

抗体アレイはどうでしょうか。 削除/引用 No.12423-4 - 2024/07/03 (水) 18:37:03 - rち ターゲット分子がある程度定まっているならば、市販の抗体アレイ（複数のタンパク質に対する特異抗体がメンブレン上に固相化されていて、メンブレンと培養上清（原理的に抗原分子を固相化した抗体が補捉するので、事前にサンプルを濃縮する必要はありません。またネガティブコントロールとして培地を使えば必ずしも無血清にする必要はありません）をインキュベーションすることで、スポットとして検出できます。同時に20~30種類くらいのタンパク質を半定量（少し高いけど正確に定量できるものもある）できます。炎症性サイトカインとか、ケモカインとか、ガン関係とか、血管新生関係とか、対象分子の機能や目的別、病気別にいろんなバージョンの膜が用意されています。ウェスタンでは分析が難しい、目的とする分子が極めて低濃度で存在するような生物材料（培養液、血清など）の分析に大変有用で、高感度かつ大変簡単なのでわたしたちは血中サイトカインの網羅的解析でよく使います。

(無題) 削除/引用 No.12423-3 - 2024/07/03 (水) 13:28:03 - 774R 普通に実験デザインすると、ネガコンとしてフレッシュ無血清培地も泳動し、そこにはBSAが含まれないことを確認済みかと勝手に思ってたが、この点は大丈夫でしょうか？ それがクリアなら、washしても細胞表面付着したBSAが洗い切れてない可能性もあるかもしれません。時間を置いてwashしてみてはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12423-2 - 2024/07/03 (水) 12:50:24 - おお 無血清培地はなんですか？BSAが入ってたりすることも多々ありますよ。

細胞培養上清のウエスタンブロッドにFBS由来の成分が残る 削除/引用 No.12423-1 - 2024/07/03 (水) 12:11:46 - あたな 初めての投稿失礼いたします。 培養細胞から分泌される因子を確認するために、培養上清を回収してウエスタンブロッドで検出しようとしています。 実験としては、次のような手順で行っています。 �@細胞を10%FBSを添加した培地で一晩培養 �APBSで３回(念入りに)洗浄してから無血清培地に交換 �B48h後に上清を回収 �C3000gで遠心,0.22umのフィルターを通して死細胞を除去 �Dアミコンウルトラ3Kで濃縮 このサンプルでウエスタンブロッドを行うのですが、交換前の培地に含まれていたFBSと思われるバンドが非常に強く出て、目的のバンド(BSAと近い分子量)がマスクされてしまいます。(ネガコンとして、FBS添加培地のみも隣に流し、同じ分子量であることを確認しています) 解決策としては、 �@PBSの洗いの回数を増やす �AELISAで検出 �BAlbuSorb,Promaxなどのウシ血清アルブミン除去キットを試す などを検討していますが、なるべくコストのかからない方法で血清成分を除去したいです。 有効な解決策をお持ちの先生がいらっしゃいましたら、アドバイスをお願いします。

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