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(無題) 削除/引用 No.12422-27 - 2024/07/16 (火) 18:22:10 - ぴ pir遺伝子を持つ大腸菌宿主でしか複製しないプラスミドだったりしないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12422-26 - 2024/07/09 (火) 03:35:50 - おお 適切な抗生物質で増やして精製したプラスミドにその抗生物質耐性遺伝子上に機能損失するような変異が入っているというのがありえないです。 どんな研究をしているのかによっては、プラスミドに薬剤耐性以外の維持機能を使って耐性遺伝子の機能解析に使うとかあるかもしれませんので全否定はしませんし、そのプラスミドが手に入るならそれでもいいでしょうけど、判断が間違っていたら同じ結果になります。プラスミドが手に入るなら同時にプラスミドに関するインフォメーションも手に入ると思いますので、情報の見直しはできるかもしれませんが、それならまずはその情報を先に手に入れるといいかと思います。 んまてよ、フレームシフトがあるから、Suppressor tRNAを補給するという奴かもしれない。

(無題) 削除/引用 No.12422-25 - 2024/07/08 (月) 22:12:37 - さと 皆様 ありがとうございます。 ともかく、変異の入っていない購入直後のものを手に入れる必要がありそうです。 何かありましたら、また相談させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.12422-24 - 2024/07/08 (月) 21:37:34 - egeria >[Re:20] おおさんは書きました : > pUC19のORFを探すとAmpRとしては２８６アミノ酸で配列のN末あたりを書き出すと > MSIQHFRVALIPFFAAFCL... > NCBI Reference Sequence: WP_000027050.1と一致します。 > この範囲の配列には不一致がありません。不一致があるのはこの上流です。 まさしくこの範囲に変異が入っています。No.12422-11で投稿された配列では111塩基目から（ATGAGTATT...）がこれに対応するORFになっていますが、この読み枠を見ていくと MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKMLKISWVHEWVTSNWISTAVRSLRVFAPKNVFQ* で終わります。本来のアミノ酸配列は MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAED... と続いていくので、VKVK以降が一致しないことがわかります。

(無題) 削除/引用 No.12422-23 - 2024/07/08 (月) 15:25:54 - おお pSA2と言うプラスミドがブラストでかかるのだけど、GenBank: PP297162.1ではアンプ耐性遺伝子が乗っていると書かれていつけど、addgene でこのプラスミド見るとStreptomycin耐性になってる。 https://www.addgene.org/52262/

(無題) 削除/引用 No.12422-22 - 2024/07/07 (日) 23:36:07 - さと おおさん、皆様 ご助言ありがとうございます。初心者であまりくわしくないもので、すみません。 フレームシフトが起こっている可能性ですね。 実は新しいラボに来たばかりで、このプラスミドの入手経緯はよく分かっていないのです、、 週明けに確認してみたいと思いますが、ともかくアンピシリンプレートで生えないので機能はしていないのだと思います。過去にプラスミドを増やす過程で、どこかで変異が入ってしまったのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12422-21 - 2024/07/06 (土) 16:51:14 - おお 前のコメントの最初の配列は、R factor 、すなわちプラスミド由来のもので、後の配列はトランスポゾン由来みたいです。それでほとんど配列が一緒にも関わらず違うORFが使われて、アミノ酸配列が違うのに機能が一緒というのは驚きですが。 因みに後の配列では、アミノ酸がここで示されたDNA配列から起こしたものと完全に一致しますが、FirstMet はATGではなく、Alternative のものが使われてます。それが大腸菌内でどれ程翻訳開始活性として強いかは専門外ですしわからないです。もしお使いのプラスミドではそこからの翻訳がほとんどされないなら、プラスミド由来の配列が実際には機能しているかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12422-20 - 2024/07/06 (土) 14:45:35 - おお pUC19のORFを探すとAmpRとしては２８６アミノ酸で配列のN末あたりを書き出すと MSIQHFRVALIPFFAAFCL... NCBI Reference Sequence: WP_000027050.1と一致します。 この範囲の配列には不一致がありません。不一致があるのはこの上流です。 ここで示されている配列のORFを探ると更に上流からのORFがみつかり、 MFIFLNTFKYVSAHETITLINASIILKKEEYEYSTFPCRPYSLFCGILPSCFCSPRNAGESKDAEDQLGARVGYIELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRIDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTMPVAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGASLIKHW これは最初に示したORFとは一致しません（最初はフレームがあったFirstMが上流にもあるのかとおもった）。ただし、このアミノ酸配列はACCESSION VTQ19588のbeta-lactamase TEM [Escherichia coli]と完全に一致します。 どうなってるんでしょうね。最初の配列が完全に一致しているのでそれが機能していると思っていいのかしら。

(無題) 削除/引用 No.12422-19 - 2024/07/06 (土) 13:47:33 - おお あ、してないわ。

(無題) 削除/引用 No.12422-18 - 2024/07/06 (土) 13:40:16 - おお https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Get&RID=8HHX90PF114 pUC19でアライメントしたら示された配列と１００％一致しますけどね。。。

(無題) 削除/引用 No.12422-17 - 2024/07/06 (土) 11:50:09 - egeria AmpRをもつ適当なプラスミド（pUC19とか）の塩基配列とアラインメントを作って確認してみてほしいのですが、1塩基欠失によるフレームシフト変異が起きているようです。具体的にはVal31のGTAのAが抜けています。 ですので、この塩基配列が正しいならば、AmpRは機能していないと考えてよいと思います。この状態でなぜプラスミドを増やせたのか不思議ですけどね。

(無題) 削除/引用 No.12422-16 - 2024/07/06 (土) 05:08:23 - さと おおさん ありがとうございます。実験の過程が原因かもしれません。 （なぜSnap Gene で表示されなかったかは不明ですが、、）

(無題) 削除/引用 No.12422-15 - 2024/07/06 (土) 03:36:12 - おお ということで形質転換のプロセス、マテリアルなどを見直してください。

(無題) 削除/引用 No.12422-14 - 2024/07/06 (土) 03:22:54 - おお ブラストの結果も示された全長１００％マッチするプラスミドが複数ヒットします。

(無題) 削除/引用 No.12422-13 - 2024/07/06 (土) 00:13:52 - おお Plasmidmapperに入力してみるとアンプ耐性遺伝子ありますね。。。

(無題) 削除/引用 No.12422-12 - 2024/07/05 (金) 21:00:27 - さと なお、他に抗生物質耐性の配列は見当たりません。

(無題) 削除/引用 No.12422-11 - 2024/07/05 (金) 20:58:41 - さと 遅くなってしまい申し訳ありません。 配列はこちらになります。すべては載せられなかったので、問題の部分の配列＋前後のみです。 ATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTT

(無題) 削除/引用 No.12422-10 - 2024/07/05 (金) 19:15:58 - Skeptics このフォーラムでよく見る状況ですよね。トピ主からのフィードバックがあればすぐにも解決する問題について、常連さんがあれこれ推理合戦を繰り広げて、その雰囲気が怖くなってトピ主さんが帰ってこない、とか。 いや、このトピ主さんは帰ってみえると思ってますが。

(無題) 削除/引用 No.12422-9 - 2024/07/05 (金) 17:26:51 - NOD >壊れていたら、どうやってこのプラスミドが大腸菌で増やせたかって言う不思議 配列見せてくれればすぐ解決するのに、推理ゲームになってるのでしんどい

(無題) 削除/引用 No.12422-8 - 2024/07/05 (金) 16:21:54 - おお >[Re:4] NODさんは書きました : >blaのORFとAmpR付与遺伝子が壊れていないかを確認しましょう。 > ベクターの配列かアクセッションナンバーをここに書くのが手っ取り早いです。 壊れていたら、どうやってこのプラスミドが大腸菌で増やせたかって言う不思議

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