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(無題) 削除/引用 No.12421-6 - 2024/07/03 (水) 13:32:24 - もり 皆様ご意見ありがとうございます！ 遠心速度については1000-1700 Gで実施されているとのことですので、一度1000Gで懸濁時間を短くすることを意識しながら進めたいと思います。 チップで突くことに関しては、かなりの時短になるとは思いますが、1000G程度ならば旋回懸濁で十分と思われますので、それでもペレットが固い場合には検討してみます。 なお、市販のコンピテントセルの分注および再凍結に関しては、私自身は20uL単位で分注していましたが、再凍結リスクを許容できないと上の判断を頂いたので、ラボのオフィシャルな方法としては導入できない現状です。 ラボ全体でライブラリは作製する予定はなく、AQUA cloning が可能な程度のコンピテントセル(10^7-10^8 cfu/ug)を多量に用意したいという形ですので、自作で十分かなと考えております。

(無題) 削除/引用 No.12421-5 - 2024/07/03 (水) 07:55:52 - 一兵卒 ピペットの先端で突き崩して剥がれてきたものをピペッティングで懸濁していました。手早く懸濁することの方が大事という指導でした。10^8弱/ug pUC程度の効率を得ていました。 でも、コストだけの問題であれば、開発者による日本語のプロトコールにあったように、市販のコンピテントセルを融かして10uLずつ分注して再凍結してそれを使えば、1回あたり￥100〜200で済みますよ。

(無題) 削除/引用 No.12421-4 - 2024/07/03 (水) 04:15:51 - たこ Gに関しては手元に学生の頃のノートないのでわからないですが、普通にピペットでほぐしていました。 バイトに間に合わない＆手が疲れるからという理由で、なんならボルテックスしたこともあります（もちろん後でバチくそ力強い指導をいただきましたが）。 コンピテンシーの定量評価はしていなかったですが、ボルテックスでも私の場合問題ありませんでしたし、ピペットでほぐした時と同等のコンピテンシーでした。 が、保証はできかねます。

(無題) 削除/引用 No.12421-3 - 2024/07/02 (火) 19:06:25 - AA 自分のプロトコルを調べたら1670 xg でした。(ベックマンJLA-10500で3000rpm) 3000rpmは時短プロトコルで、ホントは2200rpmでやれって教わったのでだいたい1000 xgくらいかも。 TBで再遠心するときってむしろペレットゆるゆるであるイメージが強いので2500 xgは強すぎるのかもしれません。 氷上でボトルを揺らして懸濁しろ、ここが大事だから。 と言われてたのでずっとそうしていましたが、やっぱりピペットでも良いんですね。

(無題) 削除/引用 No.12421-2 - 2024/07/02 (火) 18:45:55 - 774R 当ラボではそこまで苦労してないので、遠心条件を調べたところ約1700Gで行っていました。 また、昔は懸濁をプロトコルどおりチューブを揺らして行っていましたが、今は時短のために5mlピペットでピペッティングして塊を崩しています。それで特に問題は起きてません。

コンピテントセル作製時の遠心速度について 削除/引用 No.12421-1 - 2024/07/02 (火) 18:28:59 - もり 平素より、皆様のトピックにて学ばせていただいております。 Inoue法におけるコンピテントセル作りにおける遠心速度についてご助言を賜りたく、トピックを立てさせていただきます。 現在、Inoue法によってコンピテントセルの作製に取り組んでおり、SLiCEやAQUAによるクローニングに使用を目的に〜5 x10^7程度のコンピテンシーの取得に成功しております。 そこで、課題になっていることが集菌後の懸濁に30分程度かかっていることです。 2500 G でDecelを最長設定にしておりますが、transoformation bufferの懸濁にて30分と時間がかかりすぎている現状です。 ボスに相談したところ、遠心速度を800 G程度まで下げてみてはどうかと言われたのですが、ペレットが懸濁しにくい際に遠心速度を下げてもよいものなのでしょうか。 皆様のご意見や、コンピテントセル作製時の遠心速度についてお伺いいたしです。 なお、研究室内の先輩方はコンピテントセルを購入していたためノウハウは失伝している状態です。 研究費の減額に伴い、ポスドクから購入ではなく自作を指示されているため購入はかなり難しい現状です、 実験の仔細に関して下に記しておきます。 E. coli JM109 をストリークして単離したコロニーをLB 液体培地で37℃ overnight SOB 50 mL に前培養液500 uL添加し、18℃ 120rpm 14hr〜本培養(OD600=0.4~0.8) 氷冷水にてキンキンに冷やす 2500 Gで集菌 Transformation buffer 15mL 懸濁 ← 30分以上かかっております。 以下Inoue法原著通り

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