BioTechnicalフォーラム [96wellの左右wellでの細胞数の違い]

(無題)

No.12418-20 - 2024/07/09 (火) 03:40:58 - おお

叩きつけて剥がれたとしてそんなにきれいに細胞密度が端から端へと徐々に減っていくもんですかね。。。ばらつきがもっと出るような気がしますけど。まあ実際のデーターを見てないのでよくわかりませんけど。

(無題)

No.12418-19 - 2024/07/08 (月) 23:56:11 - あの

当方が以前、メーカーから聞いて知っている限りですが、
　ケラチノサイトは、強固に接着する細胞で、むしろ剥がすのに苦労するぐらいの細胞
　また何度もパッセージしたらダメな細胞

だから、既にキャラが変わって接着力を失った細胞になってしまったのではないか？　という疑問があります。

(無題)

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No.12418-18 - 2024/07/08 (月) 22:05:37 - プレート

皆様
これまでご回答いただきありがとうございました。
本日細胞を確認したところ、左右差がでない条件がでました。

やはり、細胞をキムタオルに叩きつけていたのが悪かったようで、
叩きつけずアスピレータで培地を捨てた方では左右差が出なかったです。

叩きつけることで左右差ができたのは、おそらく叩きつけ方が原因かと思います。
プレートを叩きつけるとき、プレートを左側が外側、右側が手前（手元）であったため、
外側は衝撃が強く、かつ手前側は衝撃が手で若干吸収されたのだと思います。

今回のことで、叩きつけることが細胞を剥がすということがわかり大変助かりました。
ありがとうございます。

あのさん
・コート等することは記載されておりませんでした。
・今回の試験で初めて発覚したため、これまでの試験は上手くいっていなかったと思います…
・パッセージは試験間で統一しております。

Tcid50さん
・100μLずつ分駐しています。
・自分も同じタイプのリザーバーを使っております。

(無題)

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No.12418-16 - 2024/07/07 (日) 06:14:35 - Tcid50

10 cm dish コンフルエント細胞を24 mlに懸濁してリザーバーに入れ、そこから100 ulずつ8連ピペットで分注しますが、細胞密度が左右で大きく変わったことないですよ。何μlずつ播種していますか？

(無題)

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No.12418-15 - 2024/07/07 (日) 03:59:23 - あの

そういえば、２点気になります。

ケラチノサイトて、コラーゲンとかゼラチンとかコートする必要は無かったですか？

上手くいっていたときと同じ培養プレートを使っていますか？

もし記録が無い場合でも、細胞の入手元に確認すれば教えてくれるはずです。

それから、通常のセルラインと違うので、何度もパッセージと凍結保存を繰り返すと、細胞のキャラが変わる可能性もあると思います。

(無題)

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No.12418-14 - 2024/07/06 (土) 22:52:13 - プレート

とさん
おおさん
あのさん
ありがとうございます。

検鏡はしていたのですが、一部well（しかも一区画）しか確認していないので、左右での密度差があったか確認できていないです。
検鏡をじっくりしていきます。

皆さんキムタオルに叩きつけないのですね…
確かに叩きつけると刺激や混入の危険性が残ってしまいますものね…
色々なラボの技術を伺って修正するべきだと痛感しました…

皆様のご意見を基に現在培養中ですので、
結果が出次第またご報告させていただきます。

(無題)

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No.12418-13 - 2024/07/06 (土) 11:00:50 - あの

当方も、プレート逆さ叩きつけ、はしないですね。培養のときには。

また、Eiaのときも(ウォッシャー使う)。

細胞は死にやすくて、剥がれて当たり前と考えていて、いかに人的要因よるバラツキを小さくするかを、全ての段階で考えています。

(無題)

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No.12418-12 - 2024/07/06 (土) 02:08:52 - おお

>[Re:8] プレートさんは書きました :

> 自分は先輩から教わった方法として、96wellのプレート上下逆さにしてを滅菌したキムタオルにたたきつけて培地を取り除いているのですが、この方法では細胞が剥がれてしまいますか？

私は基本的にそういうふうにはやりません。そういうふうにやるのはELISAのときとか。

細胞が剥がれるかどうかは、細胞、刺激などによると思います。結構強固にへばりついているものもありますが、細胞によってはフラスコをベンチにある程度以上の勢いで叩きつけて剥がす細胞もあります。そうやって剥がれそうな細胞でもトリプシンで剥がすこともありますけど。また何らかの処理、刺激で細胞の状態が変わった場合剥がれやすくなる可能性はあります。要するに状態が変わった細胞がごっそり除かれてしまえば、最終的に何を見ているのかわからなくなってしまいます。例えばHeLaとかM期の細胞は剥がれやすいので、培養しているフラスコを叩いたりして浮いてくる細胞を回収してまき直すとM期から細胞周期をシンクロできます。

もう一つ気になるのは培地に何らかの刺激を入れたものとコントローるとか混在しているでしょうから、そういうのがいくらかでも混じってしまわないかというのがちょっと気がかりです。

(無題)

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No.12418-11 - 2024/07/06 (土) 00:43:33 - と

2倍の差はかなり大きな差なので、検鏡すれば確実に細胞密度の差が感じられると思うのですが、確認されましたか？
ケラチノサイトを扱ったことはないのですが、そんなに接着が弱い細胞でしょうか？
コンフルエントであれば比較的接着の弱い細胞でも培地交換で2倍の差がでるほど剥がれることもないように思います。チップの先があたった部分が剥がれるようなことはあるとは思いますが、それで2倍の差が出るでしょうか？
また、一部のウェルだけが細胞数が減った（剥がれてしまった）ならわかるのですが、左から右へときれいに細胞数が減ることが、私には不思議でなりません。
ある種の反応など評価するときは、溶液添加の僅かな時間で差が生じてこのような現象が起きることはよくあるかと思いますが、細胞の播種、培地交換で2倍の差がプレートの左から右へと生じることはあるのかなと。
細胞数測定の部分で何らかの問題があるように思えてなりません。
私はまずは検鏡して細胞密度に差があるかを確認することをお勧めします。

(無題)

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No.12418-10 - 2024/07/05 (金) 22:14:27 - プレート

ぺんさん
ありがとうございます。

培地交換は一度に96well分を行っています。
培地は8連を使ってすぐにいれておりますが、やはり良くない乾燥を招いてしまいますか？
アスピレーターを使い1レーンずつ培地交換をするのが無難でしょうか？

(無題)

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No.12418-9 - 2024/07/05 (金) 15:48:41 - ぺんさん

培地交換は、一度に96well分の培地を除去してから、
新しいものを入れているのでしょうか？
8連ピペットを使ったとしても、端まで12回ですから、
最後の方は乾燥気味になるのではないでしょうか？

(無題)

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No.12418-8 - 2024/07/03 (水) 21:31:42 - プレート

みなさまありがとうございます。
>>プレートリーダーの問題
一昨年新しくした機械ですが、確認してみます。

>>最初と最後で
おおよそ2倍くらいの差がでておりました。
リザーバーでのピペッティングも意識します。

>> まくときの手法
半分入れてから半分入れ直すくらいの混和も試してみます。

あと本筋とは違うのですが、96wellの培地の交換方法にも問題があったりしますか？
自分は先輩から教わった方法として、96wellのプレート上下逆さにしてを滅菌したキムタオルにたたきつけて培地を取り除いているのですが、この方法では細胞が剥がれてしまいますか？

(無題)

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No.12418-7 - 2024/07/03 (水) 15:41:22 - わかば

細胞をまくときの手技が一番大きいと思います。

50mLチューブの時点でディスポピペット（10ｍLとか）でよく混和して、
そのままプレート半分量+αの液量をリザーバーにとり、
8連ピペットで再度混ぜつつ、手早くプレート半分に分注。
同じ手順でもう半分を分注。
以上を素早く行うと改善しないでしょうか。

予定の分注量より多めに細胞液を用意すること、
50ｍLチューブ内をよく混和して手早く処理することを気を付けています。

(無題)

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No.12418-5 - 2024/07/03 (水) 06:01:29 - と

目視での印象はどうでしょうか？
プレート自体の問題（あるロットでの問題など）の可能性とか。
あと、プレートリーダーも確認してはいかがでしょうか？
プレートリーダーに問題があるかどうかは、同じ波長で測定できる溶液をプレートに等量入れて測定するか、
細胞数測定の際に、180度回転させてセットして再測定することで簡易的に判断できると思います。

(無題)

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No.12418-4 - 2024/07/02 (火) 23:15:30 - プレート

おおさん
かねさん
ありがとうございます。

細胞は50ml チューブに入れたものを転倒混和して、リザーバーに入れたものを8連の200μLピペットマンで播種していました。
混和から播種まではすぐに行ったため、沈殿の恐れは少ないかと思います。

室温放置の危険性につきましてもご教示ありがとうございます。
一応この時同時に室温放置せずにインキュベータに入れたプレートも用意していたのですが、こちらも左右差が見えておりました。

(無題)

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No.12418-2 - 2024/07/02 (火) 00:59:16 - おお

分注する前のチューブないで細胞が徐々に沈降ているとか、沈降している底の方から細胞を取っていたとか言う可能性はないですか？
それが原因なら細胞をピペットで吸い入れるときにピッペッティングをして懸濁液を均一にするといいかと思いますが。
あとピッペットは何使ってますか？P２００用だと細胞によっては大きめの細胞、形が球状になってない細胞など吸い入れにくく思ったほど細胞が取れない可能性もあります。

＞室温で30分放置
たまにそういう話を聞くけど、インキュベーター外で培地のCO2が抜けてpHがアルカリに偏り細胞に良くないと思うのだが、大丈夫かなぁ。インキュベーター外でもpHが安定とうり文句の培地があったような気もするけど、特殊な部類だと思う。HEPES入っているからという人もいるけど、経験的にはやっぱり赤くなっているのでそれでもやっぱり大丈夫かなと思う。

96wellの左右wellでの細胞数の違い

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No.12418-1 - 2024/07/01 (月) 23:20:53 - プレート

いつも大変お世話になっております。

先日、96wellプレートにヒト表皮ケラチノサイトを5000cell/wellで播種した後、
edge effectを抑えるために室温で30分放置してからインキュベータに入れて培養をしました。
その後、コンフルエントになったところで、Cell counting kitを使い細胞数を測定したところ、左から右のwellにかけて細胞が少なくなっておりました。

edge effectとは違う問題が出て、正直困惑しております。

おそらく自分の手技によるものかと思います。
（細胞を播種するときに左から右のレーンに撒きました。
　　インキュベータには手前側に右のwellが来るようにセットしましたが、インキュベータの扉は培養中1日2回程度しか開閉しておりません。）

均一にするための方法につきましてご助言いただけますと幸いです。

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