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(無題) 削除/引用 No.12416-6 - 2024/07/02 (火) 13:03:11 - G25 それと、DNAの精製はどのようにおこなっていますか？ tailから簡便法で精製するような場合、品質は低くかつ一定しないことになりがち。PCRなんてかかればうんと増えるのだから、投入するDNAは量より品質つまり阻害的な夾雑物を持ち込むほうがはるかに有害。 精製方法、DNAのQCを見直してみては。 あるいは、crude DNA、阻害物質に強い酵素（と付属バッファー）に切り替えるとか。 お使いの酵素の説明書の増えないときのトラブルシュートにもプライマーとDNAの品質に言及されていますでしょ。それくらいは検討したのかしら。 https://lifescience.toyobo.co.jp/user_data/pdf/products/manual/DTM_101.pdf ちなみに、アリルを判別する戦略はどういうのですか？ 1. 同じプライマーセットでアリルごとに長さの異なる産物を見る 2. アリルごとに特有の領域をターゲットにして、アリル選択的なプライマーセットを用いる。 3. アリルのSNPを3'末端配列のことなるプライマーでPCRして見分ける。 4. その他

(無題) 削除/引用 No.12416-5 - 2024/07/01 (月) 10:49:46 - G25 情報がとっちらかっていて、しかも痒いところに手が届かない感じ。 >ある遺伝子のConditional KO mouseを作成途中なのですが、Total KO mouseではうまく出来ておりましたGenotypingがうまく出来ずに苦慮しております。 今現在でも、Total KO mouseならうまくいくんですか？ >DNA濃度を調整して15ug/ul程度で行っており、 どの状態の濃度？ 精製DNA、反応液中？(な訳ないか)。 反応液に投入した量の情報ならともかく、この情報いるかな？ しかも後で、 >濃度を未調整、調整済みでバンドが出たり出なかったりするような現象が起こっております。 なんて書いてあるもんだから、何がどう問題なのか混乱する。 >プライマーを変更した方がいいとは思っているのですが、もともとmouseを受注した指導教官が鬼籍に入っており、それも難しい状況です。 なぜ？ 当該マウスの情報が引き継がれてもいないということ？ それじゃ、論文にする時困るだろうに。 ひとつまず試したらいいと思うのは、今と同じデザインでいいからプライマーを合成し直して新調すること。それまでできていたPCRが不調になった時、プライマーの劣化が原因のことがある。

(無題) 削除/引用 No.12416-4 - 2024/07/01 (月) 10:00:21 - ねすみ 状況がよくわかりませんが、以前はうまくいっていたサンプルでもバンドがでなくなったのか？サンプルを変えたら安定しなくなったのか？で対処の仕方は違ってくると思います。 前者なら、手技の不手際、試薬・サンプルの劣化、などが考えられます。後者なら、DNA調製の問題の可能性が高いと思います。 プライマーや酵素を変えることで感度や増幅効率が上がることもあります。クルードサンプルでの増幅に強い酵素もあります。酵素やプライマーを変えずに対処したいということであればもう少しわかるように書くと的確なコメントをもらえると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.12416-3 - 2024/07/01 (月) 09:59:26 - おお 15ug/ulってあり得る数字なのでしょうか？ いろいろ変えてみる（プライマーや酵素）のも手だけどそれが難しいなら、 PCRの条件をタッチダウンにしてみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12416-2 - 2024/06/30 (日) 22:38:21 - 質問 第二のプライマーセットを内側領域に設計して、ネステッドPCRを試みてはどうですか？

KOマウスのジェノタイピングがうまくいきません 削除/引用 No.12416-1 - 2024/06/30 (日) 18:06:41 - M いつもお世話になります。 ある遺伝子のConditional KO mouseを作成途中なのですが、Total KO mouseではうまく出来ておりましたGenotypingがうまく出来ずに苦慮しております。 DNA濃度を調整して15ug/ul程度で行っており、Quick Taqを使用して、TOYOBOプロトコール、アニリング濃度を62度にして一時的にhetero, homoの違いはわかるようになったのですが、濃度を未調整、調整済みでバンドが出たり出なかったりするような現象が起こっております。 プライマーを変更した方がいいとは思っているのですが、もともとmouseを受注した指導教官が鬼籍に入っており、それも難しい状況です。 大変お忙しい中恐縮ですが、再現性が困難なGenotypingについて、経験のあられる先生方が多い、この場でご教示いただければ幸いです。 よろしくお願い申し上げます。

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