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ありがとうございました。 削除/引用 No.12399-7 - 2024/06/27 (木) 10:22:57 - akiboooooo 貴重なご意見をたくさんありがとうございました。 助かりました。

(無題) 削除/引用 No.12399-6 - 2024/06/26 (水) 00:48:55 - G25 書こうと思っていたこと(反応の高温化、5’-dTn-dV-3‘プライマーの使用)は早々にベテランさんたちが指摘していますが、 昔はdT15くらいが普通だったと記憶するのですけど、 長いのが主流になってきたのは、高温で反応できるRTaseが出てきたのと関係あると思います。温度が高いほど伸長を妨げるRNAの二次構造が緩和されるので、高温安定性を高めるように工学的にRTaseが改変されてきました。 SuperScript(SS)を例にすると、オリジナルのSSは反応温度37℃、その後SSII, SSIIIとバージョンアップして45℃とか55℃とかで反応できるようになりました。 それに伴い、dTプライマーが高温で安定にアニールするために鎖長が長めになってきたんでしょう。 ちなみに、ランダムプライマーのように短いプライマーを使うときは、低い温度でアニール、プライミングして、ある程度鎖長が長くなってTmが高くなったところで高温で反応させたりしますね。 dT20とdT30は何が違うか？ あまり違わないと思いますが反応温度が50℃近くだと効いてくるかも。 簡単に2℃/AT対でTmを計算するとdT20は40℃、dT30は60℃。 それと > ちなみに、CDS内部に7塩基程度のAの連続配列があると、一定の割合でそこから逆転写が始まっているデータを、今はもう公開されていないデータベースで見たことがあります。 を読んで思ったのは、反応温度を高くしたり、dTnを長くすると、そういうアーティファクトを防ぐ効果があるだろうということ。 高温では短いAストレッチにアニールしにくくなる。 dTnが長いほど短いAストレッチに対してミスマッチが多くなることになりTmを下げてアニールしにくくなる。 >Primerを注文するようにTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTを合成して使えば数百円ですみます。これでは駄目なのでしょうか？ かまわないと思います。合成・精製のグレードを上げてもまだ安上がりじゃないかな。最小スケールでも市販品の何倍も収量あると思います。 あと5’-dTn-dV-dN-3’のように3’末端2ntを散らしたプライマーもありました。ClontechのRACE kitのMarathonなど。3’のプライミング位置が揺らがないという利点。

(無題) 削除/引用 No.12399-5 - 2024/06/25 (火) 23:00:36 - SYBR master >[Re:1] akibooooooさんは書きました : > SuperScript® IV Reverse Transcriptaseでは20merです。 > 世の中には30merなんていうのも売られています。 > この違いは何か実験に影響を与えますか？ 経験的には余り差は無いですね。最近のRTaseは比較的高温(と言っても42度位）なので、その温度程度なら20でも30 mersでもさほど差は無いです。理由はRTaseの反応bufferが、一般的にPCRや制限酵素等で使用されている1価の塩濃度より高い(たしか150 mM NaCl)ので、Tm値はPCR(一般的なPCRは50 mM)の時より高いです。それ故、高塩濃度なのでPCRに希釈せずに持ち込むとsalt inhibitionにより、PCRが走らなくなります。 > 2つ目、OligodTを買うと結構高いです。１万円以上します。 > Primerを注文するようにTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTを合成して使えば数百円ですみます。これでは駄目なのでしょうか？ いえ、うちでは普通に使っていますので問題無いです。が、うちでは全長欲しいなら少し凝った配列にしています。ただ出来ればカラム精製くらいはかけてください。HPLCやPAGE精製までの純度は現在では必要ないと思っています。 >[Re:3] おおさんは書きました : > TTT TTT TTT TTT TTT TTT TV > V=C/G/A 今うちでは、上記配列を少しいじって 5'-4 base適当な配列-M13F-制限酵素サイト(NotIとか)-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TV-3'で逆転写して、M13Fと標的cDNA specific primer(GSP)にcloning用の制限酵素サイト(EcoRIやBamHI)を拭かしてPCRして、制限酵素で切断してin vitro cloningでvectorにいれてます。少し長くなるのですが、それでも3千円くらいで作成できます。 ちなみに、CDS内部に7塩基程度のAの連続配列があると、一定の割合でそこから逆転写が始まっているデータを、今はもう公開されていないデータベースで見たことがあります。

(無題) 削除/引用 No.12399-4 - 2024/06/25 (火) 22:04:42 - おお >[Re:2] うんとさんは書きました : > 自分も同じこと考えたことありますが、市販のoligo dTと同じ濃度でプライマーを頼もうとすると同じくらいの値段がかかると思います。つまり、通常のプライマーの濃度よりも高濃度のものがoligo dTです。 精製度の問題もあると思うが、逆相精製だけの乾燥したやつだと安くないか？

(無題) 削除/引用 No.12399-3 - 2024/06/25 (火) 21:41:09 - おお >[Re:1] akibooooooさんは書きました : > ThermofisherのSuperScript® IV Reverse Transcriptaseを使って完全長cDNAを合成しようと思っています。 > 遺伝子は3.5kbpと比較的長いです。 > 逆転写する際に、OligodT Primerを用いますが、これについて二つ質問です。 > 1つ目 > Takaraの逆転写酵素ではOligodT(16-18mer）といったものが用いられています。 > SuperScript® IV Reverse Transcriptaseでは20merです。 > 世の中には30merなんていうのも売られています。 > この違いは何か実験に影響を与えますか？ 特に長さとか気にした事はありません。最近はRT酵素の熱安定性が上がってきているので、長めにして高い温度で特異的、効率的に逆転者すると言う狙いはあるかも知れません。長さ過ぎると、RT後のPCRでの影響は気になるところです。ただ、 ビーズについたやつなら長めに設定してもビーズから熱変性などで回収する事を考えればRT後の持ち込みは気になりませんね。また、以下に紹介するAnchored Oligo(dT)をRT後のPCRにも使うと言う荒技があったような。それなら長めの設定はわからなくもない、GCがないのでTmをあげるために。 全長を考えているなら、ポリAの3‘末端からの余分なAストレッチを含むcDNAを避けたり、ポリAの複数箇所にアニーリングして競合したりと言うのを避けるため、Anchored Oligo(dT)を使う事もあるようです。 TTT TTT TTT TTT TTT TTT TV V=C/G/A > 2つ目 > OligodTを買うと結構高いです。１万円以上します。 > Primerを注文するようにTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTを合成して使えば数百円ですみます。これでは駄目なのでしょうか？ 実は昔いたボスが大量にdT18をカスタム合成したのが使いきれないほどあって、それ使ってます。細かく比べたことがないので、精製度の影響など未知数ですが、1kbくらいの全長CDSならなんとかなってます。まあ、特異的にプライマーでRTする事もあるのだけど。

(無題) 削除/引用 No.12399-2 - 2024/06/25 (火) 21:11:12 - うんと 自分も同じこと考えたことありますが、市販のoligo dTと同じ濃度でプライマーを頼もうとすると同じくらいの値段がかかると思います。つまり、通常のプライマーの濃度よりも高濃度のものがoligo dTです。

OligodT　Primerについて 削除/引用 No.12399-1 - 2024/06/25 (火) 18:19:25 - akiboooooo ThermofisherのSuperScript® IV Reverse Transcriptaseを使って完全長cDNAを合成しようと思っています。 遺伝子は3.5kbpと比較的長いです。 逆転写する際に、OligodT Primerを用いますが、これについて二つ質問です。 1つ目 Takaraの逆転写酵素ではOligodT(16-18mer）といったものが用いられています。 SuperScript® IV Reverse Transcriptaseでは20merです。 世の中には30merなんていうのも売られています。 この違いは何か実験に影響を与えますか？ 2つ目 OligodTを買うと結構高いです。１万円以上します。 Primerを注文するようにTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTを合成して使えば数百円ですみます。これでは駄目なのでしょうか？ 教えてくださいませ。

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