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(無題) 削除/引用 No.12389-8 - 2024/06/25 (火) 14:50:11 - 橘 公式のユーザーガイド https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/4337035_BDTv31CycSqKt_RUO_UG.pdf は確認した方が良いと思います。 私が見たことある失敗事例だと、�@エタ沈の際にペレットを落としていた、�Aプライマーにそこそこマッチする部位がインサート中にもあった、�B鋳型溶液中のEDTAが影響していた、�C鋳型をミリQに溶解して長期間放置していたため分解していた(たぶん)、�DBigDyeが劣化していた、�E純粋に実験手技が下手すぎて全ての液量がバラバラだった、ということがありました。 あと、どうやっても波形がきれいに出ないサンプルがXTerminator Purification Kitで精製したら一発できれいに読めたことがありました。 どうしようもないときは試してみると良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12389-7 - 2024/06/24 (月) 23:56:29 - SYBR master >[Re:5] おおさんは書きました : > プラスミドがてんぷれーとなら２００ngはそんなにおかしな数字ではないと思ったのだけど、、、 そうですね、「少なすぎ」はさすがに言い過ぎでした、ゴメンナサイ。 plasmidなら、40-60 fmol, PCR産物ならその1/3程度15-20 fmol程度が至適DNA量です。なので、対象DNAが長ければ長いほど必要なDNA量は増えます。この量を参考にして、必要なDNA量を見積もってください。何故plasmidの方が必要DNA量が多いかは、多分G25さんが説明してくれると思います（歴史的な部分なので、丸投げ)。 Sangerのcycle sequenceでは、鋳型DNA量が多すぎると原理的に短い断片が増えるので、raw data（実波形データ,他の人も言及しているけど、これ見ておくの大事なのよ）を見ると急激にシグナルが衰弱するのが見て取れます。逆に鋳型DNAが少なすぎると、最初っからシグナルが弱すぎて(raw dataもシグナルが弱い)、Base callerがそこから無理くりデータにするので、backgroundノイズが大きく出てしまい、配列データがおかしくなります。 昔はSangerでのトラブルシューティングについては、日本語で書かれた物も沢山有った気がするのですが、現状殆ど無くなっており、また現在では英語の方でもwebでは数が少なくなっています（確か米国の大学でも1箇所くらいだったような)。個人的に知っている範囲での日本語での説明は、EurofinのHPに有るこれくらいかもしれません。 https://eurofinsgenomics.jp/media/29305/seq%E3%83%88%E3%83%A9%E3%83%96%E3%83%AB%E3%82%B7%E3%83%A5%E3%83%BC%E3%83%86%E3%82%A3%E3%83%B3%E3%82%B02014oct.pdf ただこの中にあるStuttering after Mononucleotide Strechesの部分では、対象がplasmidで有る場合、ある程度軽減できることが1998-2001年頃には経験的には解っています。plasmidなら30-50 bpのpolyAでもキレイに読めていたはず。個人的には100bp以上のpolyAでも読めていた記憶がある。cDNAライブラリーの大規模シークエンスが行われていた時代で、理研のFantomとかが良い例ですね。ただ、2000年頃からFantomはpoyAのデータを削ってデータ登録したので、現状ではDDBJやNCBIの登録データからはそこはもう読み取れないです(最初期のdataはpolyAついていたんだけどね)。 Sangerのcycle sequenceは基本PCRの原理を利用しているの、PCRで増えない配列には弱い傾向がありますが、標的DNAがplasmidの時はそれが軽減される傾向にあることも経験的には解っていることです(当時では論文化は難しいけど、使用している酵素が基本的には違うのですが、今なら論文化(protocol系)出来るかもしれません）。

(無題) 削除/引用 No.12389-6 - 2024/06/23 (日) 17:26:18 - 悲観主義者 rawデータのシグナル強度を確認していますか。単にエタノール沈殿でサンプルをロスしていて、弱すぎるシグナルをソフトが無理やり解釈しているとそんなふうになることがあります。

(無題) 削除/引用 No.12389-5 - 2024/06/23 (日) 15:40:01 - おお 実際に波形データーをみている外注先にトラブルシューティングしてもらうのがベターだと思います。Dyeが残っていたためそのシグナルで実際のシグナルが読めてないのか（１５０ベースぐらい下流に出てくるんだったっけ３００ベースぐらいだったっけ）、それとも他の原因なのかなど判断しないと対処方法も適切な方法を選べないですし。 プラスミドがてんぷれーとなら２００ngはそんなにおかしな数字ではないと思ったのだけど、、、 エタ沈はEDTAを加えるとフリーのDyeの抜け具合がいいという話もあったと思ったけどそうしているのでしょうか？ https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/cms_081527.pdf ここの４章に書いてますね。

(無題) 削除/引用 No.12389-4 - 2024/06/23 (日) 14:52:11 - 准教授 出題者さんは自分のラボまたは組織内にシークエンサーがある環境のため、自分でエタ沈とかまでしないといけないということですかね？ 完全に横ですが、シークエンスしたいテンプレートDNAとシークエンスに使いたいプライマーを混ぜた溶液を送るだけで翌日にはシークエンス結果がメールで送られてくるサービスを多くのメーカーさんがやっています。１サンプル500円未満です（メーカー、大学によってことなると思うのでざっくりした表現にしておきます）。エタ沈とか乾燥とかする必要ないので超早くて便利です。参考にしてください。

(無題) 削除/引用 No.12389-3 - 2024/06/23 (日) 14:05:01 - みず SYBR masterさん ＞先輩とかから聞いていない部分でしょうか？たぶん貴方の、やり方に問題がありそうです。 先輩からはプロトコールだけ教わったため、コツ？などは試行錯誤していくしかないかなと考えています。 ＞これって、sampleの長さや状態(plasmidなのかPCR産物なのか)が無い状態でこの量を表示されても、plasmidなら少なすぎだし、PCR産物なら過剰量の可能性が高いですね。 失礼いたしました。使っているのはプラスミドです。具体的にはインサートをMCSに挿入し、ライゲーションができているかの確認も含めてシーケンスを行っています。 200ngでは少ないのですね…十分量だと思っていました。 ＞外注するときに、DNA量は指定されているはずですが、その部分、読んでいませんか？ DNA量も先輩からいただいたプロトコールに従っていましたので、外注先の指定は確認していませんでした。確認するべきですね。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12389-2 - 2024/06/23 (日) 00:48:57 - SYBR master >[Re:1] みずさんは書きました : > このような結果になってしまうのは、シーケンスでは読みにくい配列などが存在するのか、それともやはり自分の作業に悪い点があるからなのでしょうか？ 先輩とかから聞いていない部分でしょうか？たぶん貴方の、やり方に問題がありそうです。 > プライマー作成の際に同じ塩基の繰り返しはよくないと聞いたことがあり、同じようなイメージで何となく読みにくい配列でもあるのかと軽率に考えています。 Sangerならprimerが繰り返し配列のそばでも読める可能性はあります。条件次第ですけど。 > 以下はサイクルシーケンスの条件です > ・サンプル　約200ng これって、sampleの長さや状態(plasmidなのかPCR産物なのか)が無い状態でこの量を表示されても、plasmidなら少なすぎだし、PCR産物なら過剰量の可能性が高いですね。外注するときに、DNA量は指定されているはずですが、その部分、読んでいませんか？

シーケンスで読みにくい配列？ 削除/引用 No.12389-1 - 2024/06/23 (日) 00:03:03 - みず いつも勉強させていただいています。 分子生物学を始めたばかりの素人です。 目的の遺伝子配列をシーケンス解析し配列決定を行っているとき疑問が浮かびましたので質問させていただきます。 サイクルシーケンス後エタ沈・風乾まで自身で行い、シーケンス解析は外部機関に委託しています。そのため詳しいことは分からないのですが、帰ってくるデータは時に配列の中身がぐちゃぐちゃになっています。具体的には塩基がとびとびになっていたり、IUPAC表記が多くあったりです。 このような結果になってしまうのは、シーケンスでは読みにくい配列などが存在するのか、それともやはり自分の作業に悪い点があるからなのでしょうか？ プライマー作成の際に同じ塩基の繰り返しはよくないと聞いたことがあり、同じようなイメージで何となく読みにくい配列でもあるのかと軽率に考えています。 愚問でしたらすみません。 しっかりと配列が確認できないときには繰り返しシーケンスにかけ、うまくいくまで繰り返していますが、時間と労力・費用ばかりがかさみ根本解決にならないため、なにかアドバイスを頂けたら幸いです。 以下はサイクルシーケンスの条件です ・サンプル　約200ng ・BigDye　0.5uL ・sequence buffer 125uM 4uL ・primer 10uM 0.4uL ・N-Free water up to 20uL

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