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(無題) 削除/引用 No.12381-6 - 2024/06/21 (金) 13:21:29 - fgb サンプルとか細胞の取り違えとか大丈夫ですか。KO cellとばかり思ってた方がWT cellだったりとか。こういうこと言うと、まさか、んなこと絶対ないと言って機嫌悪くなる人もいますが、実際、たまに起きてます。dishの蓋側に細胞名を書く人がほとんどと思いますが、２つ以上のdishの蓋を同時に開けたときヤバいです。なのでわたしはdishの底の裏面にも書いてます。westernとかで一度確認した方が良いと思います。私たちは実験のたびに確認してます。

(無題) 削除/引用 No.12381-5 - 2024/06/21 (金) 10:42:52 - おお >[Re:1] Monkeyさんは書きました : > もちろんフィードバックなど、曲解はできるのですが、こういったことってありえますでしょうか。 > KOも刺激なしとありで比較しているんですよね、フィードバックとかどうしたら説明になるんですか？ 同じようなプロセス（精製法とか）で得られた全く関係ないリガンドに対するコントロールがあればもう少しはわかりやすかったかも。レセプターに結合できない変異体とか。

(無題) 削除/引用 No.12381-4 - 2024/06/21 (金) 10:06:54 - tts KOしたcellをさらにリガンドで刺激し、KO onlyからさらに増加するかを確認するのが手っ取り早く、わかりやすいのではないでしょうか？ さらに増加しなかった場合は話がわかりやすく、そうでなかった場合には悩ましい問題ですが、、、

(無題) 削除/引用 No.12381-3 - 2024/06/21 (金) 01:28:36 - おお リセプターが複数の種類存在する可能性はあるかもしれません。 その前にKOで動かなかったリセプターの直接下流の遺伝子があるのかないのかなど細かな解析は必要と思いますが、それはすでに終わってますでしょうか。それとバリデーションも済ませておいたほうがいいと思いますが（やってなかったら）。もしKOで動かないものがレセプターの下流として濃厚ならKOにプラスミドなどでレセプターを発現させて反応が回復するかやっておくほうがいいと思います。 またリレプターKOの直接的な情報伝達系のなるべく上流の活性化（リン酸化など）を蛋白レベルでみておく必要があるかもしれません。 複数のリセプターがあるような場合、リガンドの細胞へのアフィニティーを調べて、細胞表面の何がしかのものに結合することを示すということもできる実験かと思います。 リガンドで細胞で刺激して直後に細胞表面をクロスリンクして、リガンドでIP、WBしてリセプターの分子種を確認してみてもいいかもしれません。うまく行けばIP後にMSでKOしたもの以外のリセプターが同定できるかもしれません。 ところでKOは蛋白レベルで完全に完全に発現してない感じですか？とらんけーとで何がしのものが出てるとか、、、

(無題) 削除/引用 No.12381-2 - 2024/06/20 (木) 21:34:32 - あの 次はどういう経路、あるいは系統の遺伝子ですか？ 　WTでのリガンド刺激で上昇している遺伝子

リガンド刺激とKOのデータが矛盾する 削除/引用 No.12381-1 - 2024/06/20 (木) 21:05:47 - Monkey cell lineのレセプターをCas9を使ってKOし、WTとKOの両者を準備しました(n=3ずつ）。さらに、そのレセプターのリガンドで刺激したものとしていないもの、計4種類をRNA-seqにかけました。n=3なので、実際には、RNA-seqは12サンプル解析していることになります。 結果を解析したところ、WTでのリガンド刺激で上昇している遺伝子は、WTとKOのリガンドなしで比較においては、KOで減少ないしは、不変であってほしいのですが、逆に上昇しているものが多いです。 もちろんフィードバックなど、曲解はできるのですが、こういったことってありえますでしょうか。 また、みなさん、次の手として何を考えられますか。

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