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(無題) 削除/引用 No.1238-23 - 2012/12/13 (木) 00:37:04 - あてな > > 5'-XXXXXXXTC-3' > 3'-XXXXXXXAGNNCTTNNNNNffffffffffffffffffffffffffffffff-5' > > にすればそれはさけれるかな。 > > NNNNNfのぶぶんのfがTならAGNNCTができてしまいますね。少しいろいろな組み合わせをよく見てランダムな配列のところで切れる可能性がないか詳しく見ていく方がいいかと。 アドバイスありがとうございます。確かに、「CTT」とつなげれば防げそうですね。 詳しく可能性をチェックします。

(無題) 削除/引用 No.1238-22 - 2012/12/12 (水) 17:29:41 - おお 5'-XXXXXXXTC-3' 3'-XXXXXXXAGNNCTNNNNNffffffffffffffffffffffffffffffff-5' いいと思いますが、 5'-XXXXXXXTC-3' 3'-XXXXXXXAGAGCTCTNNNffffffffffffffffffffffffffffffff-5' は期待しない場所できれてしまうかもしれませんね。でもそれでも確率論で半分はのこるか、、、 5'-XXXXXXXTC-3' 3'-XXXXXXXAGNNCTTNNNNNffffffffffffffffffffffffffffffff-5' にすればそれはさけれるかな。 NNNNNfのぶぶんのfがTならAGNNCTができてしまいますね。少しいろいろな組み合わせをよく見てランダムな配列のところで切れる可能性がないか詳しく見ていく方がいいかと。

(無題) 削除/引用 No.1238-21 - 2012/12/12 (水) 11:38:29 - AP >１塩基余分にデザインというのは、平滑化するときにKlenow exo-を使って、余分に塩基を付けるということだと思いますが 固相合成をするときに、ということです。

(無題) 削除/引用 No.1238-20 - 2012/12/12 (水) 11:20:19 - あてな > pol Iを使うと5'末端のNNの突出が埋められて平滑になります。 そうですね。気付きませんでした。ご指摘ありがとうございます。 > >ちょっと不細工ですが、FFFF-3'の先に制限酵素認識配列をつけておいて、あとで切り落とすか、、、、 > 代替案で、FFF-3'の末端が平滑にならないのように、片方の鎖の末端だけ一塩基余分にデザインしたら、アダプターがライゲーションされなくなりますが、どうでしょうか。 制限酵素認識部位を使う方法の場合、認識部位に使う配列が端っこにつくのが困ります。 １塩基余分にデザインというのは、平滑化するときにKlenow exo-を使って、余分に塩基を付けるということだと思いますが、１塩基をコントロールできないのが気になります。 議論が戻ってしまうのですが、やはり、制限酵素を使った方法にしてみようかと考えています。 今、考えているのは、はじめに以下の２つのプライマーを用意して 5'-XXXXXXXTC-3' 3'-XXXXXXXAGNNCTNNNNNffffffffffffffffffffffffffffffff-5' 相補鎖を合成した後、「TCNNGA」を認識してNNの５’突出末端を作るNEBの制限酵素Hpy188IIIを使って切断して、ターゲット部分を回収するつもりです。

(無題) 削除/引用 No.1238-19 - 2012/12/12 (水) 10:18:32 - AP 細切れで申し訳ないですが、DNA合成をオーダーするときに、末端修飾（5'リン酸化、アミノ化、S化、ダイデオキシ化）など工夫をすれば、意図外のligationや平滑化を防ぐことはできそうです。

(無題) 削除/引用 No.1238-18 - 2012/12/12 (水) 09:45:28 - AP >代替案で、FFF-3'の末端が平滑にならないのように、片方の鎖の末端だけ一塩基余分にデザインしたら、 やるとしたら、FFF-3'の先にさらに一塩基余分に付けて、相補鎖をつくるプライマーはそのままにして、3'突出端にするべきですね。5'突出にしてしまうと、相補鎖を合成するときに陥没が埋められて平滑化してしまいますから。KlenowもT4 polより弱いながら、3'突出を削る活性がありますから反応条件を検討する必要があると思います。

(無題) 削除/引用 No.1238-17 - 2012/12/12 (水) 07:44:24 - AP >PCRに使う予定ですが、ニックがPCRに影響するようでしたら、E.coli DNA polymerase Iでニックを取り除こうかと思います。 どのようなPCRデザインなのかわからないので判断できませんが pol Iを使うと5'末端のNNの突出が埋められて平滑になります。 >ちょっと不細工ですが、FFFF-3'の先に制限酵素認識配列をつけておいて、あとで切り落とすか、、、、 代替案で、FFF-3'の末端が平滑にならないのように、片方の鎖の末端だけ一塩基余分にデザインしたら、アダプターがライゲーションされなくなりますが、どうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1238-16 - 2012/12/12 (水) 01:16:16 - あてな 補足説明をありがとうございます。 > 先ほど述べた方法では、主配列だけリン酸化しているので、アダプターをライゲーションしたあとに、反対鎖側にニックが残ります。 > 5'-NNXXXXXXXXXX-P-NNNNNFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF-3' > 3'-__xxxxxxxxxx-_-nnnnnffffffffffffffffffffffffffffffff-5' > それでかまわなければいいのですが、もし支障があるなら、アダプターも　5'-P-xxxxxxxxxx-3'のようにリン酸化をオーダーしておくとニックは生じません。 > そのかわり、FFFFF-3'の末端にもアダプターが（ニックを残す形で）ライゲーションされます。それを除去するにはどうしたらいいでしょうねえ。 > ちょっと不細工ですが、FFFF-3'の先に制限酵素認識配列をつけておいて、あとで切り落とすか、、、、 FFFFF-3'の末端にアダプターがつくのはまずいですし、リン酸がついていると主配列同士でライゲーションしてしまいそうなので、リン酸化無しは必須だと思いました。このテンプレートは、PCRに使う予定ですが、ニックがPCRに影響するようでしたら、E.coli DNA polymerase Iでニックを取り除こうかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1238-15 - 2012/12/11 (火) 19:38:33 - 虫の息 すみません、だいぶボケボケな発言しました。 >[Re:12] APさんは書きました : > >賢い、と思ったのですが、10bpってアニーリングできますかね？ > > クローニングのツールとしてlinkerとかAdaptorがあって、既製品もありますが、そのようにして作ります。 >

(無題) 削除/引用 No.1238-14 - 2012/12/11 (火) 16:13:25 - AP 念のため書き加えると、 先ほど述べた方法では、主配列だけリン酸化しているので、アダプターをライゲーションしたあとに、反対鎖側にニックが残ります。 5'-NNXXXXXXXXXX-P-NNNNNFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF-3' 3'-__xxxxxxxxxx-_-nnnnnffffffffffffffffffffffffffffffff-5' それでかまわなければいいのですが、もし支障があるなら、アダプターも　5'-P-xxxxxxxxxx-3'のようにリン酸化をオーダーしておくとニックは生じません。 そのかわり、FFFFF-3'の末端にもアダプターが（ニックを残す形で）ライゲーションされます。それを除去するにはどうしたらいいでしょうねえ。 ちょっと不細工ですが、FFFF-3'の先に制限酵素認識配列をつけておいて、あとで切り落とすか、、、、

(無題) 削除/引用 No.1238-13 - 2012/12/11 (火) 13:46:07 - あてな >[Re:12] APさんは書きました : > >賢い、と思ったのですが、10bpってアニーリングできますかね？ > > クローニングのツールとしてlinkerとかAdaptorがあって、既製品もありますが、そのようにして作ります。 > 勉強になります。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1238-12 - 2012/12/11 (火) 12:56:44 - AP >賢い、と思ったのですが、10bpってアニーリングできますかね？ クローニングのツールとしてlinkerとかAdaptorがあって、既製品もありますが、そのようにして作ります。 http://catalog.takara-bio.co.jp/product/tech_info_detail.asp?catcd=B1000345&subcatcd=B1000384&unitid=U100003515&masterid=M100002760

(無題) 削除/引用 No.1238-11 - 2012/12/11 (火) 12:47:55 - あてな > 賢い、と思ったのですが、10bpってアニーリングできますかね？ 2番目の方のコメントに > DNAプローブを作るときはランダムヘキサマ(n=8)でテンプレートにアニーリングさせて、クレノーで合成しますけど と書いてあったので、10bpでもアニーリングは大丈夫だと思ったのですが、実際はどうなのでしょうか？？

(無題) 削除/引用 No.1238-10 - 2012/12/11 (火) 12:30:54 - 虫の息 賢い、と思ったのですが、10bpってアニーリングできますかね？

(無題) 削除/引用 No.1238-9 - 2012/12/11 (火) 12:18:47 - あてな 回答ありがとうございました。 > 5'-P-NNNNNFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF-3' > のオリゴ(5'末端リン酸化）をオーダー。 > 3'末端の相補鎖のプライマー 3'-fffffff-5'とKlenowで二本鎖にする(小文字は反対鎖を表す）。 > > 5'-NNXXXXXXXXXX-3'と相補鎖3'-xxxxxxxxxx-5'をオーダー。アニーリングしアダプターとする。 > > 両者をligationする。 アダプター過剰にして主配列のマルチマーができにくい条件で行う。出来てしまったマルチマーはアクリルアミドゲル電気泳動などで分離除去。 Ligation条件をうまくコントロールできれば、うまくいきそうですね。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1238-8 - 2012/12/11 (火) 10:54:29 - AP 5'-P-NNNNNFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF-3' のオリゴ(5'末端リン酸化）をオーダー。 3'末端の相補鎖のプライマー 3'-fffffff-5'とKlenowで二本鎖にする(小文字は反対鎖を表す）。 5'-NNXXXXXXXXXX-3'と相補鎖3'-xxxxxxxxxx-5'をオーダー。アニーリングしアダプターとする。 両者をligationする。 アダプター過剰にして主配列のマルチマーができにくい条件で行う。出来てしまったマルチマーはアクリルアミドゲル電気泳動などで分離除去。

(無題) 削除/引用 No.1238-6 - 2012/12/11 (火) 07:37:09 - あてな > あ、そうですね。。。下側の3'の最後をダイデオキシで合成できないでしょうか。 ダイデオキシについて、あまり知らないのですが、作成したDNAをligationに使いたいと思っているので、ダイデオキシにしたらligationできるのかどうか心配です。 > まったん特定の塩基でもいいのであれば上記の酵素は候補かと。そのほか認識配列から少し遠くをきる酵素はあるようですが、マイナーできっと高いと思いますしどれくらい切れるかというてんでやってみないとという感じはしますが。 いろいろと考えてくださってありがとうございます。 末端の2bpは、4塩基x4塩基=16パターンを満遍なく合成したいので、切り口がNNになっている必要があります。 「認識配列から少し遠くをきる酵素」を探してみました。 購入できるものの中では、FauIが外側4bpの位置で、NNで切りだすので使えそうでした。 この方法で、やってみようかと思っています。 いろいろご提案ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1238-5 - 2012/12/11 (火) 06:52:04 - おお >[Re:4] あてなさんは書きました : > 先ほど、以下のようにコメントしたのですが、よく考えたらクレノーで合成するときに、2bpの突出末端部分がKlenowで埋められてしまうことに気付きました。 > > > 突出の長さは正確に2bp欲しいので、下の案を試してみたいと思います。 > > > > > 下側のXXXXXXXXXXNNNNNFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF鎖を > > > 合成しておいて**XXXXXXXXXX(もちろん下側と相補な配列)を同時に合成して、両者アニーリング, クレノーでもいいのではないかと。 あ、そうですね。。。下側の3'の最後をダイデオキシで合成できないでしょうか。 > そこで、ご提案いただいた下の案を考えてみました。 > BtsIなど、２塩基NNが突出する酵素をいくつか見つけたのですが、あいにく、3'突出末端の酵素しか見つからず、今回作りたい5'突出末端は作れそうにありません。 > BstBI www.neb.com/nebecomm/products/productR0519.asp AccI www.neb.com/nebecomm/products/productR0161.asp この辺りはまあそれなりに使える酵素ですが、ただAccIは組み合わせがいくらかあるので、、、設計しにくいかと。 そのほかちょっと使ったことないのですが、こんなのも www.neb.com/nebecomm/products/productR0598.asp http://www.neb.com/nebecomm/products/productR0101.asp EcoRIできっておいて、dATPだけのクレノーに加えると末端2塩基はフィルされません。ただ何%がフィルされてという数字をとるのが難しいかもしれません。RIとかつかうとどれだけ取り込んだとかけいさんができるかもしれませんけど。 まったん特定の塩基でもいいのであれば上記の酵素は候補かと。そのほか認識配列から少し遠くをきる酵素はあるようですが、マイナーできっと高いと思いますしどれくらい切れるかというてんでやってみないとという感じはしますが。

(無題) 削除/引用 No.1238-4 - 2012/12/11 (火) 05:22:19 - あてな 先ほど、以下のようにコメントしたのですが、よく考えたらクレノーで合成するときに、2bpの突出末端部分がKlenowで埋められてしまうことに気付きました。 > 突出の長さは正確に2bp欲しいので、下の案を試してみたいと思います。 > > > 下側のXXXXXXXXXXNNNNNFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF鎖を > > 合成しておいて**XXXXXXXXXX(もちろん下側と相補な配列)を同時に合成して、両者アニーリング, クレノーでもいいのではないかと。 > そこで、ご提案いただいた下の案を考えてみました。 BtsIなど、２塩基NNが突出する酵素をいくつか見つけたのですが、あいにく、3'突出末端の酵素しか見つからず、今回作りたい5'突出末端は作れそうにありません。 > または左側にさらに15から25ベースぐらいつけておいて、下の鎖を合成して、2塩基出るような制限酵素で切れるようにしておくとかこの場合NNNNNがどんな組み合わせでも切れないようにしこむか、制限酵素できれるはいれつがじょがいされてもいいとひらきなおるか。 もし、何かアイデアがありましたら、教えていただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1238-3 - 2012/12/11 (火) 04:01:32 - あてな 回答ありがとうございました。 > ひだりの**の部分が突出になるんですよね。10ベースもあればクレノーで伸ばせるのでは。DNAプローブを作るときはランダムヘキサマ(n=8)でテンプレートにアニーリングさせて、クレノーで合成しますけど 8bpでも合成できるんですね。知りませんでした。 突出の長さは正確に2bp欲しいので、下の案を試してみたいと思います。 > 下側のXXXXXXXXXXNNNNNFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF鎖を > 合成しておいて**XXXXXXXXXX(もちろん下側と相補な配列)を同時に合成して、両者アニーリング, クレノーでもいいのではないかと。 ありがとうございました。

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