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(無題) 削除/引用 No.12374-10 - 2024/06/18 (火) 22:55:24 - おお 動物種が違うとか、、、

(無題) 削除/引用 No.12374-9 - 2024/06/18 (火) 20:53:04 - PLMD おお様 ありがとうございます。 特にGやAに変わっているというわけではなさそうです。 先にいただいたコメントの、点変異が全てミスセンス変異なのはとても偶然に思えず、 やはり当時はこの配列で正しかった？のか、意味がある変異なのかもしれないと考えを改めつつあります。

(無題) 削除/引用 No.12374-8 - 2024/06/18 (火) 16:10:14 - おお 因みにどのアミノ酸が何に変わってますか。

(無題) 削除/引用 No.12374-7 - 2024/06/18 (火) 15:28:16 - PLMD 初老様 ありがとうございます。 ref配列を比較した際に、6つがミスセンス変異として同定され、それ以外のsynonimous変異などは一つもありませんでした。 確かに全ての点変異がミスセンス変異を起こすとはランダムに変異が入っているとしたらおかしいですね。 今全て修復したプラスミドを作製中ですので、一度獲得変異体だったのか否かについて調べてみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12374-6 - 2024/06/18 (火) 08:06:02 - 初老 ミスセンス変異が6つというのは、見つかった6つの変異の全てがミスセンスであったということでしょうか。それともさらに多くの変異があって、そのうち6つがミスセンス変異だったということでしょうか。 前者であれば多型であるにせよ変異であるにせよ、ランダムに生じたものとしては不自然であるように思えます。ポジコンとして機能するように人為的に作製した機能獲得型変異体ではありませんか？

(無題) 削除/引用 No.12374-5 - 2024/06/17 (月) 20:10:49 - PLMD G25様、AA様 早速にコメントをお寄せくださり、ありがとうございます。 やはり、保存などでは変異は起きないとのこと、安心しました。 オリジナルのプラスミドやその形質転換体がラボにあるかはわかりませんが、人もだいぶ入れ替わっているので、探すのだけでも一仕事になりそうです。 "reference配列のほうが変化"という発想はありませんでした。 確かに、その可能性はありそうです。 一度調べてみます。気づきを与えてくださり、ありがとうございました。 また、実際のシークエンスデータはありません。多型かどうかはSNPなどのvariantの可能性を含めて探しましたが、該当するものはありませんでした。 また、そのプラスミド（あるシグナル伝達ではポジコンとしてラボでは使われています。）は確かにポジコンとしてシグナルを惹起しましたので、機能的ではありそうです。 referenceが今と昔とで違う可能性や、変異部位についての情報を引き続き調べていこうと思います。 方向性が見つかりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12374-4 - 2024/06/17 (月) 18:07:35 - G25 >そのプラスミドに関しては別のラボから譲渡いただいたようなのですが、その方の論文にはall sequences were confirmedと書かれてあります。 実際に読んだシークエンスデータはもらっていないのでしょうか。 それだけ同時に置換があるのは単なる多型で、由来系統・個体がリファレンスとは違うだけかも。 mis-senseだから同義置換はなかったのですね。アミノ酸置換が位置する部位の重要性とか、アミノ酸置換の保守性（置換アミノ酸の類似性）はいかがでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12374-3 - 2024/06/17 (月) 17:43:58 - AA 2009年当時と今で、参照しているreference配列のほうが変化している可能性はないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12374-2 - 2024/06/17 (月) 16:23:24 - G25 >もしプラスミドの管理（1 ug/ulの濃度のものを-30度保存 in TE buffer）が誤っているのであればラボ内で正していこうと思います。個人的には最初の時点で変異は入っていたんではないかと疑っています。 そのプラスミドを大腸菌に戻してシングルコロニーをひろったというわけじゃないのですよね。仮に保存中に変異が生じたとしても同じ変異がすべてのプラスミド分子に同時に起こるわけもなく、特定の一分子に固有の変異にしかならないはず。 したがって、そのプラスミドストック溶液の保存中に変異が起こったと考えるのは非合理で、培養・精製した段階ですでにその配列のプラスミドのクローンで置き換わっていたと考えるのが妥当でしょう。 >仮にそのプラスミドが樹立した際（2009年）には本当に配列が正しかったとして、その後の管理や再形質転換、頻繁な凍結融解や、ベンチ内でのaccidentalな紫外線照射などで変異が導入されるようなことはあるのでしょうか 凍結融解やUVでは変異が誘発されそうにないなあ。一般的な宿主はrecA-で、UV照射されたDNA(ピリミジンダイマーを有する）は変異体になる以前に複製不能になりますし。 いずれにせよ、いかなる原因で変異が起きても、全プラスミド、全宿主細胞で同時に同じ変異体になることはありえません。 再形質転換してシングルクローンを取ってシークエンス未確認で植え継いだとか、野生型が宿主に負荷となる場合に漫然と再培養で植え継いだとかがあれば、変異体で置き換わる可能性はありますね。 完全に変異体で置き換わる前に、シングルコロニーを拾って正しいもの選んで植え継いでいればこうっはならなかったはずですけど。 仮に、わりと最近起きた変異で、まだ完全に変異体に置き換わっていないとしたら、再形質転換して、シングルコロニーをたくさん拾えば、残存した野生型が再取得できるかもしれない。 それより、オリジナルのプラスミドあるいは形質転換体のストックから起こし直すのが一番だけど、ないんですね、

プラスミドについて 削除/引用 No.12374-1 - 2024/06/17 (月) 13:46:26 - PLMD お世話になります。 某タンパク質について解析する、分子生物系のラボで中堅職をしている者です。 私自身は今のラボに二年と少し前に加わったものです。 そんな私が、ラボ内で共通に扱うプラスミドをもらい実験を行っていましたが、ベクターを載せ替えるためにそのプラスミドを鋳型にPCRをしたところ、変異が見つかり、parentalなプラスミドを見たらそこに変異があった、ということをこれまで２つのプラスミドで経験しました。 一つのプラスミドにはミスセンス変異が6つもあり、一体どうしてこんなことになったのか、と頭を悩ませています。 そのプラスミドに関しては別のラボから譲渡いただいたようなのですが、その方の論文にはall sequences were confirmedと書かれてあります。 仮にそのプラスミドが樹立した際（2009年）には本当に配列が正しかったとして、その後の管理や再形質転換、頻繁な凍結融解や、ベンチ内でのaccidentalな紫外線照射などで変異が導入されるようなことはあるのでしょうか？ 大腸菌の生育の不適切な配列がごそっと抜け落ちたり、repeat配列がある際には特別な大腸菌を使うなどがあることは存じております。 ただ、ミスセンス変異というとそういうことではないのではと思わずにいられないです。 whole plasmid sequenceをすれば、そのCDSに特異的に変異が導入されているのか、plasmidにも同様の頻度で導入されているのかはわかると思いますが、その前に皆様のご意見をお聞きしたいです。 もしプラスミドの管理（1 ug/ulの濃度のものを-30度保存 in TE buffer）が誤っているのであればラボ内で正していこうと思います。個人的には最初の時点で変異は入っていたんではないかと疑っています。

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