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(無題) 削除/引用 No.12372-6 - 2024/06/16 (日) 06:17:43 - おお もう一つブロッティングでやられそうなのはゲルシフトアッセイですかね。もともとはRIラベルのDNAと蛋白を混ぜて、淡白に結合したDNAの移動度が変わるのを検出するので、ブロッティングは必要なかったのですがRIを使わずにビオチンやDIGなどでラベルしたDNAを使い膜にTransferしてDNAを検出するという方法が今は多いと思います。比較的短いオリゴを使いますのでニトロセルロースよりナイロン、ポジティブナイロンがよく使われるようですけどニトロセルロースでもやれなくはないと思います。そのまま蛋白ごとくっつけちゃうような感じなんですかね。WBかサザンかというとよくわからないですが。 >DNAをビオチン化したプライマーで増幅してトランスファーして検出したりもしました、qPCRでもできなくはないのですが、量比を調べようとするとqPCRでは絶対定量しないといけないのでRIとまでいかなくても比較的感度が良くてPCRの立ち上がりの飽和していない状態で大体の量比が一目でわかるような手法として使ってます。 前に書いたこのことについてはポジティブチャージのナイロンを使ってます。RCRの産物は２重鎖でそのままではナイロンやニトロセルロースにはつきにくい（通常サザンでは一本鎖に変性させてからトランスファーして吸着させる）。また比較的短いので強い保持力があるのが望ましいからです。まあやりよう、のせる量とかではニトロセルロースでもワークすると思います。

(無題) 削除/引用 No.12372-5 - 2024/06/15 (土) 23:00:14 - 美南 なるほど、ありがとうございます。使うときに留意します。

(無題) 削除/引用 No.12372-4 - 2024/06/15 (土) 10:30:15 - G25 ニトロセルロースメンブレンは経年劣化で脆くなっていたりするので注意です。

(無題) 削除/引用 No.12372-3 - 2024/06/15 (土) 09:29:02 - 美南 なるほど。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12372-2 - 2024/06/15 (土) 07:23:39 - おお ニトロセルロースメンブレンはWBでもつかえます。WB用、核酸用という区別は聞いたことがありませんけど。 Pure nitrocellulose is the most frequently used membrane for the transfer of both proteins and nucleic acids. Applications Transfer of protein from SDS-PAGE gels to membrane in preparation for western blotting Transfer of a wide range of protein molecular weights and nucleic acids >500 bp https://www.bio-rad.com/en-us/product/nitrocellulose-membrane-0-45-um?ID=9b5b2069-356c-447b-a0fd-cae196945394 最近はやらなくなったといえばそうかも知れませんが、例えばゲノムになにかノックインしたとき、ノックインしたところ以外にも導入したものがIntegrationしていないことを確認するにはPCRでは難しいです。 そのほかPubmedで"Southern Blot"を検索してここ数年の論文を見てみるといいかもしれません。こういう方法論的なものはつかいようで場合によってはクリエイティブなこともできます。 ちょっと見てみますとテロメアの長さを決めるのに使ってますね。 あとは病原菌の耐性遺伝子、そのたゲノムの構造がわかるようなものでゲノムの再編成みたいなものとか、 CCGとかのリピートが増えることで病気になるような場合のリピート数とかをみるとか。 目的はチェックしてないけどPCR Southernとか最近でもやっているのが見つかります。 個人的にはRNAのメタボリズムなどで膜にトランスファーしてという実験はあまりやりませんが、手法として視野に入ってます。最近では両端が共通した長さの異なるDNAをビオチン化したプライマーで増幅してトランスファーして検出したりもしました、qPCRでもできなくはないのですが、量比を調べようとするとqPCRでは絶対定量しないといけないのでRIとまでいかなくても比較的感度が良くてPCRの立ち上がりの飽和していない状態で大体の量比が一目でわかるような手法として使ってます。

サザンブロットはやりますか？ 削除/引用 No.12372-1 - 2024/06/15 (土) 05:49:59 - 美南 先日、近所の研究室が閉鎖されることになり、いくつか古い物品をいただきました。その時にサザンブロットようのニトロセルロースメンブレンとブロッティング紙をもらったのですが、これらはウエスタンにも使えますよね？ うちはサザンはやらないのですが、というか私自身やったことも近所でやっているところも見たことがないのですが、近年はそうやらなくなった実験方法なのでしょうか？

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