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(無題) 削除/引用 No.12365-6 - 2024/06/13 (木) 20:12:21 - vtbyu AとBの間のタンパク質の差異を定量的に比較したいならば、通常はSILAC法などの確立したプロテオミクスの手法があります（比較したい2群をことなる同位体アミノ酸をいくつか含む培地それぞれで培養したのちタンパク質を抽出し、両者を等蛋白質量で混合してLC-MS/MS解析に持っていく）。A,Bのサンプルを別々に流して比較するとかですと目視でわかるほど量的に極端に大きな差異があるものしか調べることができませんし大したことは分かりません。 銀染色は糖鎖やその他個々のタンパク質の性質により染まり方がしばしば異なることがあり、比較する際に、定量性を欠くことがしばしばあります、ていうか当てになりません。定量性の面ではCBBR250染色の方が定量性あります。tada もしバンドをゲルから切り出してLC-MS/MS解析するならば、普通のCBBは色素でカラムや配管内を汚すことがあるのでColoidal Blus染色液kitなどLC-MS/MSに適した染色液を使いましょう。

(無題) 削除/引用 No.12365-5 - 2024/06/13 (木) 08:55:46 - TS 要は、タンパク質濃度を測定して、同じタンパク質量のサンプルをゲルに流したんだけど、銀染色すると同じ量のようには見えない、ということでしょうか。 Lysis bufferはタンパク質測定法にコンパチブルですか。BCAにせよBradfordにしても。 ゲルは何％で、分子量マーカーはいくつからいくつくらいが見えていますか（分離できていますか）。

(無題) 削除/引用 No.12365-4 - 2024/06/13 (木) 08:35:44 - ねすみ FBS入りの培地で培養した細胞を回収するときに、PBSで1回軽く洗った程度でlysisすると結構な量のBSAが残存することがあります（PBSの量や洗い方などで程度は変わりますが）。顕著に濃く出るバンドはBSAということはないですか？もしBSAと同じサイズのバンドなら培地からのBSAの持ち込みの可能性はあるかなと思いました。

(無題) 削除/引用 No.12365-3 - 2024/06/13 (木) 02:21:21 - あの Lcmsmsを用いて、何の指標について比較したいのですか？

(無題) 削除/引用 No.12365-2 - 2024/06/13 (木) 02:13:07 - おお なんだかさっぱりわからんのですが、、、 質問するにあたって要領を得ないのはまだ実験を始めたばかりでどこが重要で要点をまとめられないのかもしれないですが、それならこれを期に頑張ってみてください。発表とかそう言うので必要になってくると思いますので。 a bは培養して得られたって言うけど、それは分泌蛋白なの？培養したのは何？哺乳動物とか、バクテリアとか酵母とか、あるいはユーグレナ、クラミドモナス、、、さらにはモデル生物としては使われないような独自の生物とか、、、 上記のことに関連するけど、培養した培養液を得たのか、培養した菌あるいは細胞を得たのか、、、いずれにしろ精製はしたのか、どのようにしたのか、、、例えば哺乳動物の細胞の培養液にはたいていBSAなどが入っている場合が多いです。培養液に分泌されたからってa bだけがあるわけではありません。そういう場合、もしかしたらその銀染でそまっている濃く出るバンドはBSAでbと被っているとか言うのも可能性があるかと思います。そもそも、それぞれのレーンに何マイクログラム乗せたのかです。たとえばa bだけが溶けているサンプルで１ug泳動したとして、銀染色ではあまりにも感度が良すぎるとおもいます。それでバンドが薄い（科学的ではないですけど）となると、目的のものは１ugもないと判断せざるおえません。 また、銀染色は定量性に乏しいですし、大抵の染色方法は蛋白の配列、アミノ酸組成、修飾の有無で染色の強さが変わってきます。ただCBBはそれでも一応定量には使われますし、Bradfordで定量したなら、ほぼ同じ染色色素のCBBでやるとある程度同じような結果にはなるかと思います。 上記の事を踏まえて、実験系について差し支えない程度で書いていただければと思います。 もしかしたら、BSAがあるような培地からニッケルカラムで精製したとかということなのかなと思い始めてますが。BSAはニッケルカラムに高い親和性があるので。

SDS-PAGEの染色 削除/引用 No.12365-1 - 2024/06/12 (水) 19:45:33 - ルル SDS-PAGEを行っていて分からないことがあります。 そのため、皆様のご考えをお聞きしたいです。 目的としては、LCMSMSを用いた比較解析(比較物をa.bとする)を行いたいと考えています。 a.bは、異なる条件下で培養。 その中で、タンパク質に着目して実験を行っておりまして、まずタンパク質の定量を行います。 定量の時点では、a.bは同程度のタンパク量が取れていることが確認されました。 ゲルに対して適切な濃度になるようにa.bを希釈し、流します。 流れ切ったら、銀染色で染色を行うのですが、bに比較してaが著しく、1レーン当たりの色が薄いです。 しかし、bで顕著に濃く出るバンドの位置には、aでも濃く現れています。 それ以外の場所は薄いと言った感じです。 この際に同程度のタンパク量が取れ、希釈のミスをしてない事を前提に考えると、培養した条件でレーンの色の薄さが出たと言うことなのでしょうか？ 仮にそうなのであれば、何故そのような事が起きる/考えられるのでしょうか？ 知識不足や説明不足の箇所があると思いますが、皆様のお力を貸して欲しいです。 何卒宜しくお願いします。

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